胸腺基质淋巴细胞生成素基因的克隆与表达

摘要

胸腺基质淋巴细胞生成素（TSLP），最早发现于培养的小鼠胸腺基质细胞系中，是一种新型的、与白细胞介素-7（IL-7）类似的细胞因子，优先表达于肺、肠、皮肤等上皮细胞，尤其在超敏反应性炎症部位表达极高。功能性TSLP受体复合体是由TSLP受体（TSLPR）和IL-7受体α链（IL-7Rα）组成。体外研究显示，TSLP能够促进树突状细胞（DC）的活化和成熟，活化的DCs能表达聚集辅助T细胞2（Th2）的化学因子胸腺和活化控制趋化因子（TARC）和巨噬细胞源趋化因子（MDC）。另外，被TSLP激活的DCs（TSLP-DCs）还可以启动CD4+T细胞前体向Th2细胞转化，这些Th2细胞能够产生过敏性因子IL-4、IL-5、IL-13和肿瘤坏死因子-α（TNF-α），同时减少IL-10和干扰素-γ（IFN-γ）的生成。这些细胞因子通过促进免疫球蛋白E（IgE）、嗜酸性粒细胞和黏液的产生而启动过敏性炎症。基础和临床研究均证明了TSLP的表达和过敏性皮炎以及哮喘之间有直接的联系，提示TSLP可能在过敏性疾病的发病机制中扮演重要角色。 本研究用OVA诱导小鼠哮喘，根据已知的小鼠胸腺基质淋巴细胞生成素基因序列设计引物，测得小鼠肺中TSLP mRNA表达量显著升高，并将扩增的该基因与原核表达载体pET28a（+）连接，转化感受态大肠杆菌DH5α，通过酶切鉴定阳性克隆。再将成功构建的重组质粒pET28a（+）-TSLP，转化至大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中，IPTG诱导表达融合蛋白。SDS-PAGE结果显示在约20 KD附近出现目的蛋白。通过对宿主菌的表达条件如培养基组成，诱导剂浓度，诱导温度等进行了优化筛选，结果表明：在TB+M9（1：1）培养基中，37℃下使用终浓度0.4 mmol／L的IPTG诱导3h，融合蛋白表达量提高到全菌蛋白的18.6％左右，比未优化前增长约15％。本研究为下一步纯化，抗体制备提供了基础，而且有助于认识特应性皮炎、哮喘等炎症的发病机制，也将为治疗此类疾病提供有效的治疗靶位。

目录

文摘

英文文摘

声明

一、文献综述

1 TSLP基因及其表达

1.1TSLP基因

1.2TSLP基因的表达

1.3TSLP蛋白结构

2 TSLP受体基因及其表达

2.1TSLP受体基因

2.2TSLP受体基因的表达

2.3TSLP受体蛋白结构

3 TSLP与过敏性疾病

3.1TSLP和过敏性皮炎以及哮喘的联系

3.2TSLP在过敏性炎症中的分子机制

4 本研究的目的和意义

二、材料和方法

1 材料

1.1实验动物

1.2质粒和菌株

1.3主要试剂

1.4主要溶液

1.5仪器

2.方法

2.1 OVA致敏小鼠

2.2 RT-PCR实验

2.3 TSLP在大肠杆菌中的克隆

2.4 TSLP在大肠杆菌中的表达

2.5 表达条件的优化

2.6 澄清裂解物的制备

三、结果与分析

1 小鼠肺组织中TSLP mRNA表达结果

2 重组载体的鉴定

3 表达条件的优化

3.1不同温度对重组蛋白表达量的影响

3.2不同培养基对重组蛋白表达量的影响

3.3不同诱导剂浓度对重组蛋白表达量的影响

四、讨论

1 包涵体形成的原因

2 增加蛋白可溶性的方法

2.1诱导温度的优化与筛选

2.2培养基优化与筛选

2.3 IPTG浓度的选择

参考文献

附录

致谢