赤拟谷盗iap基因的克隆、表达模式及其分子进化分析

摘要

细胞凋亡在生物体的发育、维持体内稳态和免疫抵御外界侵害等方面发挥着重要的作用。凋亡抑制蛋白(IAP)是一系列包含一到三个baculovirus IAP repeats(BIR)结构域的蛋白家族,它通过结合caspases,发挥其抑制细胞凋亡的作用,同时它也受到IAP抑制因子的调节。本研究对鞘翅目昆虫赤拟谷盗(Tribolium castaneum)体内的两个细胞凋亡抑制蛋白基因(Tiap1和Tiap2)进行了克隆,其中Tiap1全长1017bp,其中含有两个BIR结构域和一个RING环,Tiap2全长1485bp,其中含有三个BIR结构域和一个RING环。推测的TIAP1蛋白和家蚕中的LAP(GENE ID:692576)相似性最高,相似度为55.95％,而TIAP2和果蝇中的IAP2(GENE ID:36748)最相似,相似度为53.37％。系统进化树分析显示,TIAP1和TIAP2因功能结构域BIR数目不同而没有聚为一支,同时TIAP1的BIR2结构域与TIAP2的BIR3更为相似而不是与TIAP2的BIR2相似。这暗示有的iap基因BIR拷贝在昆虫发生之前就可能发生了丢失,而导致分化。
　　 同时为了进一步研究Tiap1f和Tiap2的时空表达,用半定量RT-PCR研究两个目的基因在赤拟谷盗幼虫发育中的13、15、17、19、21、23和25日龄七个时期的表达量的差异,发现Tiap1和Tiap2均恒量表达,并表达量较高。说明iap基因在幼虫整个生长发育期间均起重要的作用。利用杆状病毒表达系统,成功构建了三个重组杆状病毒Bacmid-Tiap1,Bacmid-Tiap2,Bacmid-Mx,为进一步进行其功能方面的研究打下基础。

目录

文摘

英文文摘

1.前言

1.1 IAP蛋白研究概况

1.1.1 IAP蛋白家族

1.1.2 IAP蛋白家族的分子结构

1.1.3 IAP蛋白调节细胞凋亡的作用

1.1.4 IAP蛋白调节泛素化过程

1.1.5 IAP和IAP抑制蛋白

1.1.6 IAP的其它作用

1.2 杆状病毒表达系统(Bac to Bac系统)

1.3 本实验的研究目的及意义

2.材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 材料来源和饲养方法

2.1.2 实验样本的搜集

2.1.3 主要试剂

2.1.4 所用引物

2.1.5 实验中主要溶液的配置

2.1.6 主要实验设备和仪器

2.2 实验方法

2.2.1 赤拟谷盗幼虫的收集

2.2.2 赤拟谷盗幼虫总RNA的提取

2.2.3 赤拟谷盗幼虫各个时期总RNA的提取

2.2.4 反转录,单链cDNA的合成

2.2.5 PCR反应

2.2.6 Tiap1和Tiap2在赤拟谷盗幼虫不同发育时期的表达量分析

2.2.7 含目的基因的杆状病毒的构建(Bac to Bac)

3.结果与分析

3.1 赤拟谷盗Tiap1和Tiap2目的基因的克隆

3.2 Tiap1和Tiap2的序列相似性分析

3.3 TIAP1和TIAP2蛋白二级结构的预测

3.3.1 TIAP1蛋白二级结构的预测

3.3.2 TIAP2蛋白二级结构的预测

3.4 TIAP1和TIAP2蛋白三级结构的预测

3.5 Tiap1和Tiap2基因在赤拟谷盗不同发育时期的表达量分析

3.5.1 赤拟谷盗幼虫7个日龄总RNA的提取和检测

3.5.2 半定量RT-PCR检测

3.6 含有Tiap1,Tiap2,Mx-ag的杆状病毒的构建

3.6.1 目的基因与载体pFastBacTM1连接

3.6.2 重组Bacmid的形成

3.6.3 提取纯化重组Bacmid

3.6.4 转染sf9细胞,获得杆状病毒

4.讨论

4.1 赤拟谷盗iaps基因的克隆、序列特征

4.2 表达模式分析

4.3 赤拟谷盗IAPs分子进化分析

4.4 重组Bacmid和昆虫杆状病毒的构建

参考文献

在校期间论文发表情况

致谢