海洋放线菌氨基酸腺苷化结构域的克隆、表达和酶活性测定

摘要

非核糖体多肽(NRPs)代表了微生物中大部分具有医药、农业和生物化学研究价值的多肽类天然产物。氨基酸腺苷化结构域(A结构域)是非核糖体多肽合成过程中的关键酶类，它负责结合和激活一个特异性识别的氨基酸底物并掺入其到NRP生物组装线上。Salinispora作为第一个被报道和确证的固有海洋性放线菌属，一直以来备受瞩目，而S.arenicola CNS-205正是该属放线菌中的代表菌株之一，其基因组中蕴含丰富的“沉默”次级代谢产物基因簇。
　　 为发掘海洋放线菌S.arenicola CNS-205中的相关NRPS沉默基因簇，本研究采用PCR技术，从基因组总DNA中扩增出两个假定的氨基酸腺苷化结构域基因--sare0357和sare0718，并对两个基因的特征和可能的功能进行了生物信息学分析。分别构建了sare0357基因的原核重组表达质粒(pET23a-sare0357、pET28a-sare0357、pET42a-sare0357)及sare0718基因的原核重组表达质粒(pET23a-sare0718、pET28a-sare0718、pET42a-sare0718和pGEX-2T-sare0718)。将以上原核重组表达质粒转化E.coli BL21(DE3)，经IPTG诱导表达后，进行了目的蛋白的亲和层析纯化及Western blotting鉴定。结果显示：在E.coli BL21(DE3)中表达的Sate0357重组蛋白主要以包涵体形式存在；在E.coli BL21(DE3)中表达的Sare0718重组蛋白也主要以包涵体形式存在，但其GST融合蛋白则获得了较明显上清形式的表达。为了进一步鉴定Sate0718-GST融合蛋白的生物化学功能，本文采用Thomas J.McQuade等新近提出的非放射性高通量鉴定A结构域的比色测定法(即无机焦磷酸酶偶联法结合孔雀石绿-钼酸铵化学显色定磷法)，以20种常见蛋白质合成氨基酸作测试底物，对其进行了底物筛选和酶动力学参数测定。实验结果表明：Sare0718的确具有氨基酸腺苷化功能，在体外可通过ATP的消耗特异性识别和激活L-丙氨酸，进一步测得的酶动力学参数为Km=0.1164±0.0159(mM)，Vmax=3.1484±0.1278(μM/min)，kcat=12.5936±0.5112(min-1)。
　　 本论文首次对海洋放线菌S.arenicola CNS-205的两个未知氨基酸腺苷化结构域基因sare0357和sare0718进行了分子克隆和蛋白表达。对可溶形式表达的Sate0718-GST融合蛋白进行了体外酶活性测定，从而鉴定了一个新的L-丙氨酸腺苷化结构域。该工作为下一步探讨S.areniocola CNS-205中包含sare0718基因的完整未知NRPS基因簇及其“沉默”代谢产物的结构功能阐明奠定了基础。同时，本文也丰富了海洋放线菌来源NRPS腺苷化结构域的底物特异性和密码子领域的研究，为NRP组合生物合成及体外酶系合成预备了一个可用的新组件。