Sigma B在单核细胞增生李斯特菌耐受抗生素中的作用

摘要

[目的]单核细胞增生李斯特菌是重要的革兰氏阳性食源性致病菌。近年来的报道显示该菌耐受抗生素的能力有不断增强的趋势。Sigma B(σB，李斯特菌中应对环境胁迫的主要调控因子)在多种革兰氏阳性细菌中负责压力应答转录调控，参与金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌对抗生素的耐受。为了探讨单核细胞增生李斯特菌的耐药机制，我们对Sigma B在耐受抗生素中的作用进行了初步研究。
　　 [方法]①建立并优化检测单核细胞增生李斯特菌耐药程度，利用噻唑蓝活体染色法(MTT法)检测最小抑菌浓度(MIC)；②检测和比较单核细胞增生李斯特菌野生菌株EGDe和其σB缺失突变菌株EGDe△sigB对盘尼西林青霉素、氨苄西林青霉素、利福平、硫酸庆大霉素、四环素盐酸和红霉素六种抗生素的最小抑菌浓度(MIC)；③在测定的MIC的基础上，利用MTT法比较EGDe和EGDe△sigB在1×MIC、2×MIC和8×MIC的氨苄西林青霉素、红霉素和利福平三种抗生素中的生长活性，绘制生长迟滞曲线。④采用反转录PCR(RT-PCR)方法，检测EGDe和EGDe△sigB两种菌株在有和无利福平胁迫下四个基因rpoB、rsbU、kat和fri(这四个基因所编码的蛋白质的表达量在革兰氏阳性菌的模式菌枯草芽孢杆菌中与利福平的胁迫正相关，因此作为单核细胞增生李斯特菌耐受利福平的Marker)的表达量，从转录水平分析EGDe和EGDe△sigB菌株中这四个基因与利福平之间的关系，探究σB介导的单核细胞增生李斯特菌耐受抗生素的分子机制。
　　 [结果]①EGDe对盘尼西林青霉素(0.16μg/mL)、四环素盐酸(0.25μg/mL)和硫酸庆大霉素(0.5μg/mL)的MIC高于EGDe△sigB(分别为0.08μg/mL、0.125μg/mL和0.125μg/mL)；四环素对EGDe的最小抑菌浓度是对EGDe△sigB的最小抑菌浓度的两倍，庆大霉素对EGDe的最小抑菌浓度是对EGDe△sigB的最小抑菌浓度的四倍。而此两种菌株对氨苄西林青霉素、红霉素和利福平的MIC没有差别，分别为0.19μg/mL、0.125μg/mL和10.032μg/mL。②比较氨苄西林青霉素、红霉素和利福平对EGDe和EGDe△sigB的生长迟滞曲线显示，EGDe△sigB对这三种抗生素的添加更为敏感，恢复生长所需的迟滞时间更长，而且其迟滞程度随着抗生素浓度的增加而增强。③EGDe和EGDe△sigB在有和无利福平胁迫下四个基因rpoB、rsbU、kat和fri的转录表达结果显示：rpoB的表达不依赖σB，也不受抗生素胁迫的影响，表达量在两种菌株中以及有无抗生素胁迫均稳定不变；kat和fri的表达与σB正相关，而且受到利福平的诱导；在没有利福平时，EGDe△sigB中rsbU的表达明显高于EGDe，当给予利福平刺激(4×MIC)，EGDe△sigB中rsbU的表达下降，EGDe中rsbU的表达上升，并稍高于EGDe△sigB中rsbU的表达，暗示rsbU的表达不仅与利福平胁迫相关，而且似乎在sigB缺失时有补偿其功能的作用。
　　 [结论]在多数革兰氏阳性菌如枯草芽孢杆菌和金黄色葡糖球菌中，压力胁迫应答调控因子Sigma B参与耐受外界多种不利因素。我们的实验结果也表明，σB在单核细胞增生李斯特菌对抗生素的耐受中起到重要调节作用。σB不仅参与耐受作用细胞膜的抗生素，还参与耐受抑制蛋白质合成类抗生素。单核细胞增生李斯特菌耐受利福平的分子机制与枯草芽孢并不完全相同，表明细菌对抗生素的耐受机制具有种属特异性。对不同细菌的耐药机制进行深入研究，将有助于研发新的抗菌药物，以及正确合理地应用现有抗菌药物。