泛素C末端水解酶-L1活性抑制对tau蛋白降解及其机制研究

摘要

泛素C末端水解酶L1（UbiquitinC-terminalhydrolaseL1，UCH-L1）是泛素-蛋白酶体系统(ubiquitin-proteasomesystem，UPS)中一种重要的去泛素化酶(deubiquitinating-enzymes，DUBs)，参与并维持大脑中神经元的正常结构及认知功能。Tau蛋白是神经组织中的主要微管相关蛋白之一，其生理学功能是促进神经元细胞骨架与微管的装配。异常修饰的tau蛋白可以在体内逐渐聚集形成神经原纤维缠结继而引发神经变性疾病。研究表明，UCH-L1活性与神经原纤维缠结数量负相关，提示UCH-L1与tau蛋白的异常病变密切联系。因此本研究重点探讨UPS系统中UCH-L1功能障碍对神经瘤细胞(N2acell)中tau蛋白的代谢和功能的影响及其可能机制。
　　本实验用不同浓度(2.5、5、10μM)的UCH-L1活性抑制剂LDN处理N2a细胞1h，利用免疫印迹技术检测细胞的UPS系统中多聚泛素和单体泛素含量的改变;用免疫印迹和免疫共沉淀的方法分别检测细胞中tau蛋白泛素化、tau蛋白总量和tau蛋白磷酸化以及tau蛋白微管结合功能的改变;利用Thioflavine-S和AT8染色来观察β-折叠结构的异常聚集体的形成以及该聚集体和磷酸化的tau蛋白的共定位关系;利用免疫印迹技术检测细胞中PSD-95的含量和CREB的活性变化，初步探索了UCH-L1活性抑制与突触结构和记忆相关蛋白合成的关系。实验结果发现:(1)细胞中多聚泛素含量随着LDN处理浓度的增大而逐渐增加，而单体泛素的含量则是呈LDN剂量依赖性减少的(P＜0.05);(2)细胞中tau蛋白泛素化水平随着LDN浓度的增加显著上升(P＜0.05);(3)与对照组相比，总tau蛋白、tau-Thr205、Thr231、Ser396位点的磷酸化显色反应均呈现出LDN剂量依赖性的增加(P＜0.05);(4)通过紫杉醇稳定微管后，在细胞提取液的上清中检测到的tau蛋白（游离的tau蛋白）含量呈LDN剂量依赖性增加(P＜0.05)，而沉淀中tau蛋白（与微管紧密结合的tau蛋白）的含量逐渐减少，说明随着UCH-L1活性被抑制，tau蛋白与微管的结合能力逐渐减弱;(5)分别用AT8抗体（识别tau-Ser202/Thr205位点）和Thioflavine-S染色（识别异常β-折叠结构的蛋白）进行细胞内的免疫荧光共定位。结果发现，随着抑制剂LDN浓度的加大，AT8和Thioflavine-S的显色程度均逐渐加强，且两者在胞内具有共定位关系。这说明LDN处理诱导了胞内蛋白质的异常聚集，而过度磷酸化的tau蛋白与蛋白质的异常聚集直接相关;(6)LDN处理导致记忆相关蛋白CREB的磷酸化程度以及突触后致密区蛋白质PSD-95水平显著减少(P＜0.05)。以上结果表明，UCH-L1活性抑制可能通过影响泛素的正常循环来阻碍tau蛋白经UPS系统的降解，引起tau蛋白微管结合功能的改变以及tau蛋白相关的蛋白质异常聚集，更可能进一步参与到影响突触正常结构和神经元记忆相关蛋白的合成。

目录

声明

摘要

1 引言

1．1 泛素-蛋白酶体降解系统

1．2 UCH-L1的结构和功能

1．3 UCH-L1生物学功能与神经变性疾病

1．4 Tau蛋白与泛素-蛋白酶体系统的关系

1．5 研究目的和意义

2 实验材料和方法

2．1 主要使用抗体和试剂

2．2 主要使用器械

2．3 细胞传代培养

2．4 LDN处理抑制UCH-L1活性

2．5 收集样品

2．6 BCA法检测蛋白浓度

2．7 免疫印迹(Western blotting)

2．8 免疫共沉淀(Immunopreeipitation)

2．9 免疫荧光细胞化学

2．10 数据的统计分析

3 结果

3．1 LDN处理对N2a细胞中UCH-L1含量的影响

3．2 LDN处理后细胞内泛素循环的改变情况

3．3 LDN处理诱导tau蛋白发生异常泛素化修饰

3．4 UCH-L1活性的抑制与tau蛋白降解之间的关系

3．5 LDN处理导致了tau蛋白与微管结合障碍

3．6 Thioflavine-S染色法观察蛋白质的异常聚集情况

3．7 LDN处理对CREB、CREB-pSl33和PSD-95含量的影响

4 讨论

4．1 UCH-L1的生物学活性与tau蛋白代谢的关系

4．2 UCH-L1活性抑制与tau蛋白生理功能以及tau蛋白异常聚集物形成的关系

4．3 UCH-L1的活性与突触结构和记忆相关蛋白活性调控的关系

5 结论

参考文献

附录

致谢