芜菁花叶病毒CDN1株系植物表达载体构建和芜菁花叶病毒CHN5株系cDNA克隆

摘要

芜菁花叶病毒是十字花科作物上的一种重要病原物.该文在分析芜菁花叶病毒NIa蛋白酶在多聚蛋白上识别位点基础上,设计了新的编码NIa蛋白酶识别位点的序列.同时根据芜菁花叶病毒各株系基因组保守的非限制性内切酶识别位点,设计出多克隆位点序列.在此基础上,将含有多克隆位点和编码NIa蛋白酶识别位点的Adaptor通过PCR介导插入到芜菁花叶病毒CDN1株系全长cDNA的NIb与CP区之间的NIa蛋白酶识别位点之后,将芜菁花叶病毒CDN1株系全长cDNA侵染性克隆pVIR95T改造成一个可利用的基因插入型表达载体pVIR95TM.利用DNA合成和PCR的方法得到人α-降钙素基因相关肽的编码序列DNA,将这段DNA插入到pVIR95TM载体的多克隆位点中,构建成在病毒寄主植物中表达人降钙素基因相关肽的表达载体pVIR95TCa.根据芜菁花叶病毒各株系保守序列,设计引物,利用免疫捕获RT-PCR的方法获得芜菁花叶病毒CHN5株系覆盖其全长基因组94﹪的长约9.4Kb的DNA片段,并克隆到T-载体中去.用芜菁花叶病毒cHN5株系cDNA中长8.45Kb的DNA片段,替换pVIR95TM中cDN1株系cDNA的相应部分,构建芜菁花叶病毒cHN5株系的侵染性克隆载体pVIRCHN5.

目录

文摘

英文文摘

声明

1前言

1.1 TuMV概述

1.1.1 TuMV生物学

1.1.2 TuMV分子结构

1.2植物RNA病毒侵染性全长cDNA克隆

1.2.1侵染性克隆载体的构建

1.2.2侵染性克隆质粒在大肠杆菌中扩增的稳定性

1.2.3影响侵染性克隆对寄主植物侵染活性的因素

1.2.4侵染性克隆cDNA体内转录表达的优点

1.2.5植物病毒侵染性克隆的应用

1.2.6侵染性cDNA克隆注意事项

1.3植物病毒表达载体的研究

1.3.1病毒表达载体发展史

1.3.2植物病毒表达载体的优点

1.3.3植物病毒表达载体构建策略

1.3.4植物病毒表达载体的应用

1.3.5植物病毒表达载体存在的问题

1.4降钙素基因相关肽研究

1.4.1 CGRP的分子结构

1.4.2 CGRP的分布

1.4.3 CGRP的生物学功能

1.5本项目研究的目的和意义

2材料和方法

2.1试验材料

2.1.1供试载体

2.1.2毒源

2.1.3 TuMV单克隆抗体

2.1.4供试健康寄主

2.1.5质粒载体及受体菌

2.1.6供试PCR酶类及相关试剂

2.1.7供试限制性内切酶及修饰酶

2.1.8供试分子量标准

2.1.10供试生化及分子生物学试剂

2.1.11主要仪器

2.1.12 PCR引物

2.2试验方法

2.2.1将pVIR95T侵染性克隆改造成具有多克隆位点的表达载体

2.2.2利用pVIR95TM构建人降血钙素基因相关肽(hCGRP)表达载体

2.2.3 TuMV CHN5株系cDNA克隆

3结果与分析

3.1 pVIR95T双酶切

3.2第一中间载体pBV95MS克隆的PCR筛选

3.3 PCR介导pBV95MS中Adaptor的引入

3.4第二中间载体pBV95MSI双酶切

3.5 pVIR95T单克隆PCR筛选

3.6 pVIR95TM侵染活性鉴定

3.7一步法RT-PCR病毒粒子检测

3.9 pVIR95TCa单克隆PCR筛选

3.10 pVIR95TCa克隆中hCGRP编码序列分析

3.11 TuMV CHN5株系免疫捕获RT-PCR扩增结果

3.12 CHN5 cDNA阳性克隆PCR鉴定

3.13 TuMVCHN5株系CP基因序列分析

3.14 TuMV CHN5 PCR扩增

3.15 pVIR95TM质粒的双酶切

3.16重组质粒pVIRCHN5 PCR分析

3.17 pVIRCHN5酶切分析

3.18 pVIRCHN5 DNA序列分析

4结论与讨论

4.1创新.点

4.2讨论

4.2.1病毒核酸的获得

4.2.2长片段的RT-PCR

4.2.3病毒载体活性鉴定

4.2.4 TuMV CHN5株系cDNA克隆的可能利用价值

4.2.5 TuMV作为表达载体的缺陷

参考文献

附录A：碱裂解法质粒DNA小量提取

附录B：大肠杆菌感受态细胞的制备及转化

附录C：pVIR95TCa载体以CP-F引物测序结果

附录D：TuMV CHN5株系CP基因测序结果

附录E：pVIRCHN5载体中以NIa-F引物测序结果

缩写词

致谢

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