噬菌体展示筛选肠病毒71型3A相互作用蛋白

摘要

肠道病毒71型(Enterovirus71，EV71)是引起人类手足口病的主要病原体。EV71病毒基因组RNA编码4种结构蛋白以及2A～2C和3A～3D七种非结构蛋白。3a是病毒复制的必需基因，基因产物非结构蛋白3A是一个多功能蛋白，可以引起细胞内膜结构的改变，参与病毒复制复合体的形成，并作用于细胞内蛋白分泌途径，阻止蛋白从内质网转运至高尔基体。3A非结构蛋白C端疏水区可以与膜结构直接结合，N端亲水区具有多个功能域，但目前与3A相互作用的宿主细胞蛋白的研究报道较少. 本论文研究主要通过噬菌体展示技术筛选与3A蛋白相互作用的宿主细胞蛋白。根据EV713a基因序列设计引物，通过PCR扩增得到3A蛋白前60个氨基酸编码序列，将其与pET28a(+)原核表达载体连接，转化大肠杆菌DH5α获得重组表达质粒，然后转化大肠杆菌BL21经IPTG诱导表达His-3A-60aa蛋白，通过SDS-PAGE电泳及Western Blot检测目的蛋白的表达，表达的重组蛋白经Ni-NTA亲和纯化。以纯化的His-3A-60aa蛋白为靶蛋白，应用T7噬菌体展示技术对人肺细胞cDNA文库进行筛选。经过4轮筛选后，选择19个阳性克隆，对筛选产物进行DNA序列分析及同源性研究，初步筛选到ribosomal protein L27a，ATP synthase F0subunit6，ferritin light chain蛋白可能与人肠道病毒3A蛋白相互作用。本论文研究内容为进一步研究人肠道病毒71型3A蛋白发挥功能和及病毒致病的机制提供了一定参考。

目录

声明

摘要

1．1人肠道病毒71型概述

1．1．1人肠道病毒分类

1．1．2 EV71感染后的临床症状

1．1．3 EV71复制周期

1．1．4 EV71 3A蛋白概述

1．2噬菌体展示技术简介

1．3pET原核表达系统

1．4研究目的及意义

2．1菌株与质粒

2．2实验仪器

2．3实验试剂

2．4常用培养基的配制

2．4．1LB液体培养基(1L)

2．4．2LB固体培养基

2．4．3顶层培养基

2．5常用溶液的配制

2．5．3 Tricine SDS-PAGE(Trieine聚丙烯酰胺凝胶电泳)所用溶液

2．5．4Western Blot缓冲液

2．5．6蛋白质纯化相关缓冲液

2．5．70．1M异丙基硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)

2．6噬菌体筛选相关溶液

2．7各种抗生素

2．7．1卡那霉素(Kalamycin，Kana)

2．7．2羧苄青霉素(Carbenicillin，Carb)

3实验方法

3．1．1设计引物

3．1．2 PCR产物回收及纯化

3．1．3LiCl法提取质粒

3．1．4双酶切pET28a(+)与回收PCR产物

3．1．5酶切产物回收

3．1．6目的基因与载体连接

3．1．7 CaCl2法制备DH5a感受态细胞

3．1．8转化

3．1．9质粒提取

3．2．2pET28a(+)-3A-60aa转化感受态细胞BL21

3．2．4Tricine-SDS-PAGE电泳

3．2．5Western Blot检测

3．3His-3A-60aa融合蛋白大量表达

3．4．3纯化3A-60aa融合蛋白

3．5用脱盐柱脱盐

3．6Bradford法测定3A-60aa蛋白浓度

3．7利用噬菌体展示技术筛选3A相互作用蛋白

3．7．1原始文库滴度测定

3．7．2T7噬菌体文库扩增及保存

3．7．3扩增后文库的滴度测定

3．7．6PCR鉴定

3．7．7PCR产物序列测序及同源性分析

4实验结果

4．1．3重组质粒pET28a(+)-3a-60aa的序列测定

4．3 His-3A-60aa蛋白纯化

4．4 His-3A-60aa纯化蛋白Western Blot鉴定

4．5蛋白含量的测定

4．5．1标准曲线的制作

4．5．2 His-3A-60aa蛋白含量的测定

4．6．2PCR鉴定

4．6．3序列比对及同源性分析

4．7讨论

参考文献

攻读学位期间发表的学术论文

致谢