人类博卡病毒-1型启动子分析及非结构蛋白NS1反式作用的研究

摘要

人类博卡病毒-1(Human bocavirus1，HBoV1)归类于细小病毒科，细小病毒亚科，博卡病毒属。基因组全长约5.5kb，含左端唯一启动子，编码两个非结构蛋白NS1(nonstructural protein)和NP1(nuclear phosphoprotein)，两个结构蛋白VP1(viral structural protein1)与VP2(viral structural protein2)。NP1是博卡病毒的特有蛋白，对其研究已经取得一定的进展，如存在一个非典型的核定位信号，调节炎症因子的表达，诱导细胞凋亡等等。但作为在病毒感染细胞后最先被转录和翻译且对其基因组复制必须的非结构蛋白NS1，却研究甚少。
　　本课题对我们前期研究中分离到的武汉HBoV1病毒株(pWHL-1 NCBI GeneBank: GU139423)的启动子及NS1进行了初步研究。将全长252nt的启动子截短突变，运用双荧光素酶报告系统检测各截短突变的表达活性。结果显示，在96-145nt内有一些可能的转录因子结合位点，对启动子的活性有重要的影响，而146-196nt为启动子的核心区域。对96-145nt内的部分核心元件进行点突变后，发现CAAT-box的突变会导致启动子的活性显著降低，而TATA-box及CREB、CdxA两个可能的转录因子结合位点的突变对其活性却无显著影响。同样运用双荧光素酶报告系统探究了HBoV1的NS1对自身启动子及转录因子AP-1、NF-κB、STAT3和GAS启动子的正调控活性，发现NS1的274-379aa为反式作用的关键性区域，AP-1、NF-κB、STAT3启动子受NS1的调控，对GAS启动子活性并无显著影响。并将NS1基因全长及截短克隆到pEGFP-N1载体中，研究其在细胞内的定位，证实在180-274aa内有入核信号(NuclearImport Signal，NLS)，340-562aa内有核输出信号(Nuclear Export Signal，NES)。
　　HBoV1启动子的分析、NS1对自身启动子正调控活性及NS1在细胞内定位的研究结果，为病毒蛋白的表达及其复制机制提供了参考数据;并首次发现NS1对NF-κB、AP-1、STAT3这几种涉及炎症反应的主要转录因子启动子具有正调控作用，揭示了NS1可能与HBoV1的致病性有关，为进一步研究HBoV1致病的分子机制提供了参考。

目录

声明

摘要

第一章 前言

1．1 病毒结构

1．2 流行病学

1．3 混合感染

1．4 传播

1．5 感染靶标器官和发病机理

1．6 持续感染

1．7 诊断

1．8 风险因素

1．9 治疗

1．10 小结

1．11 pEGFP真核表达系统

1．12 双荧光素酶报告系统

第二章 实验材料

2．1 载体、菌株与细胞系

2．2 试剂

2．3 实验所需各种抗生素

2．4 实验用各种溶液

2．4．1 LB液体培养基

2．4．2 LB固体平板及抗性筛选平板制备

2．4．3 DMEM细胞培养基配制

2．4．4 PBS缓冲液配制

2．4．5 胰蛋白酶溶液配制

2．5 引物设计

2．5．1 HBoV突变引物设计

2．5．2 NS1截短引物设计

第三章 实验方法

3．1 HBoV1启动子及各截短突变表达活性的检测

3．2 检测HBoV1启动子在其它哺乳动物细胞系中的活性

3．3 HBoV1启动子全长及各截短突变的活性检测

3．4 HBoV1启动子各点突变的的克隆及活性检测

3．5 NS1对HBoV1启动子的调控作用

3．6 NS1的亚细胞定位

第四章 实验结果

4．1 HBoV1启动子在哺乳动物细胞中的活性

4．2 HBoV1启动子在293T细胞内的高表达活性

4．3 HBoV1启动子关键区域的鉴定分析

4．5 NS1蛋白对HBoV1启动子的反式作用活性

4．6 NS1对炎症相关转录因子的调节

4．7 NS1在细胞内的定位

第五章 结果讨论

参考文献

硕士期间发表论文

致谢