多重PCR同步检测MDV、APV和EDSV的技术研究

摘要

家禽养殖在我国具有悠久的历史，随着我国经济快速的发展，养禽业的发展规模与速度与日俱增，而制约其发展的主要难题是禽病，尤其是病毒性疾病。其中APV、MDV和EDSV是三种鸡的B类传染性疾病。通常，用于检测病原体的主要方法有病毒的分离与鉴定、血清学鉴定以及PCR方法等。本文所要研究的多重PCR方法虽与常规PCR原理相同，但可以用于多种病毒的检测，且与常规单一PCR一样灵敏，是一种快速、有效的检测方法，在病毒检测领域具有广泛的应用市场。
　　本研究利用DF-1鸡胚成纤维细胞分别增殖了MDV、APV和EDSV，并利用异硫氰酸胍法提取病毒DNA，然后根据三种DNA序列分别设计了1对特异性引物，并将扩增的片段克隆到pMD18-T载体中，以此建立了可同时检测三种病毒的多重PCR方法，并优化了多重PCR反应条件，最终确定了多重PCR反应体系为20μL:0.2μL GoTaq Flexi DNA polymerase(5U/μL),4μL5×GoTaq Flexi buffer,0.4μL dNTP(10mM),2.4μLMgCl2(25mM),APV-F/R0.4μL,MDV-F/R0.4μL,EDSV-F/R0.2μL，模板各1μL，灭菌水8.0μL;反应程序为:94℃，5min;94℃，30s，54℃，30s，72℃，30s，循环40次;最后72℃，10min。
　　利用优化后的多重PCR方法分别检测了MDV、APV、EDSV以及任意组合，反应结果与预期结果一致，还检测了其他对禽类危害也较大的病毒，如NDV、AIV、ALV、IBDV和IBV，均无扩增片段，说明该方法具有较强的特异性。利用构建的阳性克隆质粒，研究了多重PCR检测的灵敏度，多重PCR检测APV的灵敏度为103copies/μL，检测MDV和EDSV的灵敏度同为104copies/μL。并且讨论了多重PCR与单一PCR检测一种病毒的灵敏度以及多重PCR中另一种病毒对检测该病毒灵敏度的影响。
　　利用建立的多重PCR方法检测了30份从本地农贸市场收集的禽粪便样，包括蛋鸡粪便样、乌鸡粪便样、鸭粪便样以及鸽子粪便样，发现没有阳性结果，但是若人为污染这些粪便样，将病毒液人为加到粪便样中，可以利用该方法检出。同样，采用此方法从13份南极企鹅粪便样和2份贼鸥粪便样中检出了MDV。因此，本方法这种快速、灵敏而且特异性强的优势，有助于研究三种病毒的流行病学、临床诊断以及控制疫病。

目录

声明

摘要

第一章 文献综述

1 马立克氏病毒检测方法的研究进展

1．1 MDV的分子生物学特征

1．2 MDV的检测方法

2 禽痘病毒检测方法的研究进展

2．1 APV的分子生物学特征

2．2 APV的检测方法

3 减蛋综合征病毒的研究进展

3．1 EDSV的分子生物学特性

3．2 EDSV的检测方法

4 多重PCR的发展与应用

第二章 研究内容

1 引言

2 材料与方法

2．1 材料

2．2 方法

3 结果与分析

3．1 病毒增殖

3．2 三种病毒的克隆

3．3 多重PCR反应条件优化

3．4 特异性检测

3．5 灵敏度研究

3．6 实际样品检测结果

3．7 人工粪便样品检测结果

3．8 企鹅粪便样品检测结果

4 讨论

4．1 多重PCR的建立

4．2 多重PCR的可行性

4．3 多重PCR与企鹅病原微生物的检测

5 结论

参考文献

致谢