邻苯二甲酸丁基苄酯小鼠神经毒性的体内和体外研究

摘要

目前研究已经发现了有关于邻苯二甲酸丁基苄酯(Butyl benzyl phthalate，BBP)的生殖、发育、氧化损伤及内分泌具有一定的毒性干扰作用，然而BBP对动物和人类的神经毒性以及BBP在体内具体的作用机制究竟是怎么样的呢？目前还尚待进一步深入的进行研究与探索。
　　本研究采用体外细胞活力测定、神经细胞毒性实验、凋亡作用和体内整体动物小鼠行为学实验、酶活测定、显微荧光技术相结合的实验方法，来进行BBP神经毒性的综合评价。本研究还平行比较了BBP、DBP以及它们共同的代谢产物MBP对细胞的毒性效应;通过对脑组织切片进行分析、神经递质的变化情况来初步探讨BBP对小鼠学习与记忆能力的影响情况以及可能存在的分子机制。
　　本研究在体外研究中主要是通过MTT法和Hoechst33258染色来进行邻苯二甲酸丁基苄酯的细胞毒性评价;通过对染毒细胞ROS、MDA、GSH含量的检测来探究BBP对小鼠神经瘤细胞的氧化损伤效应。分别采用浓度为的BBP、DBP、MBP来染毒细胞，通过对染毒细胞ROS、MDA、GSH含量的检测来比较这三种物质对小鼠神经瘤细胞的毒性强弱。
　　在进行体内试验时，利用一系列的浓度梯度分别为0（对照组），50，250及1，250mg/kg的BBP连续两个周对实验小鼠进行灌胃染毒，同时通过一系列的行为学经典实验:Morris水迷宫，悬尾试验以及强迫游泳试验，反映BBP对小鼠学习记忆能力的影响。分别测定了脑、肝、肾组织的氧化损伤水平。为了进一步探究BBP毒性的可能存在的分子机制，测得了左脑组织中5-HT((5-hydroxytryptamine)和p-CREB含量的变化情况。
　　根据实验结果发现BBP对细胞和组织均有损伤作用。大脑海马切片图显示，随着BBP的暴露，小鼠海马区细胞不完整性逐渐在增加，当BBP的暴露浓度达到了最高浓度组即1，250mg/kg时，海马区细胞开始凋亡，而且约有1/3的背侧海马细胞（控制小鼠空间学习记忆能力）受到损伤，BBP高浓度的暴露造成了海马CA1区与DG区的神经元表现出迟发性的空间学习记忆功能障碍。在BBP暴露之后，降低了神经递质5-HT的水平，从而通过cAMP/PKA所介导的信号通路下调了CREB磷酸化水平，进一步减弱了CREB的下游分子事件，从而影响了行为学的表现。

目录

声明

摘要

1．文献综述

1．1 BBP简介

1．2 BBP的理化性质

1．3 BBP的来源与用途

1．3．1 BBP的来源

1．3．2 BBP的用途

1．4 BBP毒性作用的研究进展

1．4．1 生殖毒性

1．4．2 发育毒性

1．4．3 氧化损伤和内分泌干扰作用

1．5 研究背景、内容以及意义

2．材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 受试细胞及受试动物

2．1．2 实验仪器

2．1．3 实验所需主要试剂及试剂盒

2．2 BBP对N2a细胞毒性作用实验方法

2．2．1 培养N2a细胞

2．2．2 染毒液的配制

2．2．3 细胞铺板和细胞染毒

2．2．4 测定N2a细胞MTT

2．2．5 测定ROS(氧自由基)水平及显微荧光照相

2．2．6 BBP对细胞中丙二醛(MDA)含量的影响

2．2．7 BBP对细胞中谷胱甘肽(GSH)含量的影响

2．2．8 观察N2a细胞凋亡

2．2．9 BBP、DBP、MBP的毒性比较

2．3 BBP对昆明小鼠学习和记忆能力影响的实验方法

2．3．1 染毒方法

2．3．2 Morris水迷宫实验

2．3．3 悬尾实验

2．3．4 强迫游泳实验

2．3．5 组织匀浆的制备

2．3．6 氧自由基水平的测定

2．3．7 丙二醛(MDA)含量的测定

2．3．8 谷胱甘肽(GSH)含量的测定

2．3．9 小鼠大脑海马组织切片分析

2．3．10 小鼠脑组织的5-HT和p-CREB的测定

2．3．11 统计学分析

3．实验结果

3．1 BBP体外毒性研究结实验结果

3．1．1 N2a细胞形态

3．1．2 MTT实验结果

3．1．3 细胞凋亡的染色检验

3．1．4 细胞中ROS水平及细胞显微荧光图

3．1．5 MDA实验结果

3．1．6 GSH实验结果

3．1．7 BBP、DBP、MBP的毒性比较

3．2 BBP对小鼠学习与记忆能力影响的实验结果

3．2．1 昆明小鼠体重的变化

3．2．2 Morris水迷宫的实验结果

3．2．3 悬尾实验结果

3．2．4 强迫游泳实验结果

3．2．5 BBP对昆明小鼠大脑海马区的影响

3．2．6 BBP对小鼠脑部、肝脏、肾脏中ROS水平的影响

3．2．7 BBP对脑、肝、肾组织中MDA和GSH水平影响

3．2．8 5-HT的改变

3．2．9 脑组织中CREB磷酸化分析

4．讨论

参考文献

攻读学位期间发表的学术论文

附录 英文缩略词表

致谢