棉花(Gossypium hirsutum)纤维发育的转录调控及非生物胁迫应答研究

摘要

棉花不仅是世界上重要的经济作物，也是纺织工业的重要原料和战略物资。棉花纤维细胞是一种易于分离且较长的植物细胞，其细胞次生壁90％以上的成分为纤维素，因此，棉花纤维也被作为一种研究植物细胞伸长、细胞壁建成以及纤维素生物合成的模型之一。棉花纤维是由胚珠（种子）外珠被表皮细胞经分化起始、伸长（初生壁合成）、增厚（次生壁合成）以及脱水成熟等过程发育而成的单细胞表皮毛。其中，纤维细胞的起始决定了最终纤维的数量，纤维细胞的伸长决定了成熟细胞的长度，次生壁合成决定了纤维的强度。因此，克隆棉花纤维发育相关基因并解析其基因产物的功能及分子调控机制不仅具有重要的理论意义，而且对提高棉纤维产量和品质具有重要的应用价值。本实验室从棉花中分离了26个NAC基因家族成员(cDNA)，分别命名为GhNAC1-26。本文对其中一个NAC转录因子(GhNAC1)在棉纤维次生壁加厚过程中的功能进行了研究。此外，本文也对一个编码棉花丝裂原活化蛋白激酶的GhMPK17基因进行了研究。主要研究结果如下:
　　1.GhNAC1在棉纤维发育过程中的表达分析
　　GhNAC1与拟南芥中NST1、NST2以及SND1(NST3)的同源性较高，且基因结构类似。通过qRT-PCR实验结果发现，除了在下胚轴中具有微弱的表达外，GhNAC1在棉纤维发育的次生壁加厚初期优势表达，且随着纤维发育该基因表达量逐渐升高，至开花后20天其在纤维中的表达量达到峰值。GhNAC1启动子表达模式与其组织表达情况也较为一致。另外，GhNAC2在伸长和次生壁加厚期的棉纤维中特异表达，其在纤维中的表达谱与GhNAC1类似。
　　2.GhNAC1过量表达对棉纤维次生壁发育的影响
　　为了探究GhNAC1在棉纤维发育中的功能，构建了GhNAC1过量表达载体（GhNAC1OE）和RNA干扰(RNAi)载体，转化棉花，获得大量转基因棉花植株。通过组织切片、观察统计、X射线衍射、GC-MS等方法分析发现，在GhNAC1过量表达的情况下，棉花叶柄木质部细胞中木质素与纤维素含量增多，且在皮层以及髓细胞中出现了异位沉积的现象，棉纤维长度变短，细胞壁增厚，纤维素结晶度增加，不同发育时期的棉纤维细胞壁中的单糖组分含量发生改变。有关RNAi转基因棉花的表型及遗传等方面的分析正在进行中。
　　3.GhNAC1转录因子验证及其互作蛋白分析
　　亚细胞定位及酵母自激活实验证实，GhNAC1及GhNAC2均属于转录因子家族成员。利用酵母双杂交技术，以GhNAC1(NAC domain)为“诱饵”，在棉纤维cDNA文库中筛选互作蛋白。对筛选结果中感兴趣的蛋白重复酵母双杂交实验，发现GhNAC1蛋白之间能够形成同源二聚体，且具有较强的相互作用能力。GhNAC1与GhNAC2以及泛素-蛋白酶体途径中的E2泛素化接合酶之间也能够发生结合，但它们之间的相互作用较弱。另外，pull-down实验进一步证实GhNAC1在体外也能够形成同源二聚体。
　　4.GhNAC1蛋白降解途径分析
　　文献报道，NAC转录因子的调控主要包括转录后调控和翻译后调控，其转录水平的高低主要受到miRNA的控制，而翻译水平的调控则依赖于泛素-蛋白酶体介导的蛋白降解途径以及某些酶类的修饰来完成。通过观察不同处理条件下GhNAC1-eGFP转基因拟南芥中的荧光数量及强度，初步判断其蛋白的降解与蛋白酶体有关。RNA、蛋白质的半定量实验进一步证实了上述判断，免疫沉淀的结果则为GhNAC1蛋白被打上泛素化标签提供了直接的证据。基于上述原因，在翻译后水平，GhNAC1有可能是通过泛素-蛋白酶体途径发生降解的。
　　5.GhNAC1自调控分析
　　利用35S∷GhNAC1和GhNAC1p∷GUS转基因拟南芥进行杂交，对F2代的阳性杂交株以及GhNAC1p∷GUS转基因植株的2周小苗和6周成苗进行GUS染色后发现，无论正交或是反交，在GhNAC1过量表达的情况下，GUS信号出现的强度和范围均有所增强和增大。实时定量PCR实验也证实，杂交株中GUS表达量要高于转基因株系。另外凝胶迁移阻滞实验(ElectrophoreticMobility Shift Assay, EMSA)的结果显示GhNAC1能够结合在自己的启动子上。上述实验表明，GhNAC1可能对自身产生一个正向的调控作用。
　　6.GhNAC1对下游基因的转录调控分析
　　为了研究GhNAC1转录因子对下游基因的调控，分离克隆了12个可能位于GhNAC1下游的目标基因的启动子序列。借鉴以往报道的拟南芥中能够与SND1发生结合的顺式作用元件的基序，利用EMSA技术，找到了一些受GhNAC1直接调控的靶标基因，这些基因不仅包括上游的转录因子，而且含有下游参与细胞壁建成和修饰的功能基因，进而总结出了能够与GhNAC1发生结合的顺式作用元件的序列集合——一段具有13个碱基的不完全回文序列，并对GhNA C1的下游基因，尤其是与纤维素合成相关的基因在GhNA C1过量表达转基因棉花纤维中的转录水平进行了分析。RNAi转基因植株中的基因表达情况以及进一步的转录组分析正在进行中。
　　7.GhMPK17基因克隆鉴定及功能研究
　　从棉花cDNA文库中分离了一个编码丝裂原活化蛋白激酶的基因，并将其命名为GhMPK17。实时定量PCR分析表明，在NaC1、甘露醇及ABA处理后，GhMPK17在棉花中的表达量上升。而且，与野生型拟南芥相比，过量表达GhMPK17的转基因拟南芥在NaCl、甘露醇及外源ABA胁迫的条件下显示出更高的种子萌发率、根伸长率和子叶绿叶率，这暗示过量表达GhMPK17能够减弱拟南芥对ABA的敏感性，增强植株对盐和渗透胁迫的抗性。进一步研究表明，过量表达GhMPK17能够减少拟南芥中H2O2含量，导致植株中ABA及非生物胁迫相关基因的表达发生改变。综上所述，GhMPK17可能参与棉花对非生物胁迫应答及ABA信号通路。

目录

声明

摘要

第一章 文献综述

1．1 棉花

1．1．1 棉花进化

1．1．2 棉纤维发育

1．2 植物细胞壁

1．2．1 植物细胞壁组成

1．2．2 植物次生壁发育的调控网络

1．2．3 棉花细胞壁

1．3 植物NAC转录因子

1．3．1 NAC结构及分类

1．3．2 NAC功能

1．3．3 NAC表达调控

1．4 立题依据及研究意义

第二章 GhNAC1／2基因克隆、同源进化及组织表达分析

2．1 实验材料

2．1．1 植物材料

2．1．2 菌种和载体

2．1．3 GhNAC1／2基因的cDNA

2．1．4 工具酶及商品化试剂盒

2．1．5 常用存储液

2．1．6 常用缓冲液

2．1．7 培养基

2．2 实验器材

2．3 实验方法

2．3．1 GhNAC1／2基因及其编码蛋白序列分析

2．3．2 植物材料的准备

2．3．3 棉花gDNA提取

2．3．4 GhNAC1／2全长序列的克隆

2．3．5 棉花各组织总RNA的抽提

2．3．6 RNA的纯化

2．3．7 反转录

2．3．8 PCR检测及定量分析

2．3．9 GhNAC1启动子的调取

2．3．10 农杆菌LBA4404感受态的制备及电击法转化

2．3．11 棉花遗传转化

2．3．12 GUS染色及观察

2．4 结果

2．4．1 GhNAC1和GhNAC2基因克隆及序列分析

2．4．2 GhNAC1／2蛋白进化及同源性分析

2．4．3 GhNAC1-26在棉花中的组织表达

2．4．4 GhNAC1基因启动子表达模式分析

2．5 讨论

2．5．1 GhNAC1和GhNAC2同属于NAC家族

2．5．2 GhNAC1和GhNAC2在纤维次生壁发育阶段高量表达

2．5．3 GhNAC1启动子活性在纤维次生壁形成前期逐渐升高

第三章 GhNAC1在棉纤维次生壁形成过程中的功能研究

3．1 实验材料

3．1．1 植物材料

3．1．2 菌种和质粒

3．1．3 工具酶及商品化试剂盒

3．1．4 常用存储液

3．1．5 常用缓冲液

3．1．6 培养基

3．1．7 常用化学试剂

3．2 实验器材

3．3 实验方法

3．3．1 GhNAC1过量表达以及RNAi载体构建

3．3．2 农杆菌LBA4404感受态的制备及电击法转化

3．3．3 棉花遗传转化

3．3．4 棉花gDNA提取

3．3．5 棉花RNA的提取

3．3．6 棉花RNA的纯化

3．3．7 反转录

3．3．8 PCR检测及定量分析

3．3．9 棉花叶柄的石蜡切片制作及组织染色

3．3．10 棉纤维的超薄切片制作

3．3．11 X射线衍射

3．3．12 细胞壁单糖组分提取及其衍生化

3．4 结果

3．4．1 GhNAC1过量表达和RNAi转基因棉花的获得及其阳性检测

3．4．2 GhNAC1转基因棉花的表型分析

3．5 讨论

3．5．1 GhNAC1过量表达导致次生壁物质异位沉积

3．5．2 GhNAC1过量表达导致棉纤维长度变短，厚度增加

3．5．3 GhNAC1过量表达改变了棉纤维中纤维素的相对结晶度

3．5．4 过量表达GhNAC1改变了不同发育时期棉纤维细胞壁中单糖组分的含量

3．5．5 棉花中NAC家族成员之间可能存在功能冗余

第四章 GhNAC1／2互作蛋白的筛选、验证及翻译后修饰

4．1 实验材料

4．1．1 植物材料

4．1．2 菌种和载体

4．1．3 工具酶及试剂盒

4．1．4 常用存储液

4．1．5 缓冲液

4．1．6 培养基

4．2 实验器材

4．3 实验方法

4．3．1 GhNAC1／2蛋白结构域分析

4．3．2 载体构建

4．3．3 拟南芥的培养

4．3．4 拟南芥转化

4．3．5 拟南芥阳性苗的筛选及鉴定

4．3．6 拟南芥gDNA提取

4．3．7 拟南芥RNA的提取

4．3．8 反转录

4．3．9 PCR检测及定量

4．3．10 酵母自激活

4．3．11 融合蛋白毒性检测

4．3．12 酵母双杂交

4．3．13 蛋白表达及纯化

4．3．14 Pull-down assay

4．3．15 免疫沉淀

4．3．16 western杂交

4．4 结果

4．4．1 GhNAC1／2的亚细胞定位

4．4．2 GhNAC1／2的转录自激活能力

4．4．3 GhNAC1蛋白互作分析

4．4．4 GhNAC1蛋白的泛素化修饰

4．5 讨论

4．5．1 GhNAC1通过二聚体形式来发挥功能

4．5．2 GhNAC1可能会通过泛素化途径发生降解

第五章 GhNAC1自调控分析

5．1 实验材料

5．1．1 植物材料

5．1．2 菌种和载体

5．1．3 工具酶及试剂盒

5．1．4 常用存储液

5．1．5 缓冲液

5．1．6 培养基

5．2 实验器材

5．3 实验方法

5．3．1 载体构建

5．3．2 拟南芥的培养

5．3．3 拟南芥转化

5．3．4 拟南芥阳性苗的筛选及鉴定

5．3．5 拟南芥的杂交

5．3．6 拟南芥gDNA提取

5．3．7 拟南芥RNA的提取

5．3．8 反转录

5．3．9 PCR检测及定量

5．3．10 带有MBP标签的GhNAC1蛋白的表达纯化

5．3．11 EMSA

5．4 结果

5．4．1 转基因及杂交拟南芥的GUS染色

5．4．2 转基因及杂交拟南芥中GUS的表达量

5．4．3 EMSA

5．5 讨论

5．5．1 转录调控中的反馈调节

5．5．2 GhNAC2对GhNAC1的影响

第六章 GhNAC1对下游基因的转录调控

6．1 实验材料

6．1．1 植物材料

6．1．2 菌种和载体

6．1．3 工具酶及试剂盒

6．1．4 常用存储液

6．1．5 缓冲液

6．2 实验器材

6．3 实验方法

6．3．1 克隆与棉花次生壁形成相关基因的启动子

6．3．2 次生壁相关基因启动子区域SNBE基序的查找

6．3．3 载体构建

6．3．4 棉花遗传转化

6．3．5 棉纤维RNA提取

6．3．6 棉纤维RNA的纯化

6．3．7 反转录

6．3．8 qRT-PCR

6．3．9 EMSA

6．4 结果

6．4．1 次生壁相关基因启动子的克隆以及SNBEL基序的查找

6．4．2 EMSA

6．4．3 与次生壁合成相关基因的表达分析

6．5 讨论

6．5．1 GhNAC1的直接靶标基因

6．5．2 GhNAC1能够结合的顺式作用元件

6．5．3 棉纤维中受到GhNAC1影响的基因

6．5．4 次生壁合成调控网络的保守性

第七章 GhMPK17在植物应答高盐和渗透胁迫中的功能

7．1 引言

7．2 实验材料

7．2．1 植物材料

7．2．2 菌种和载体

7．2．3 工具酶及试剂盒

7．2．4 常用存储液

7．2．5 常用缓冲液

7．2．6 常用培养基

7．3 实验器材

7．4 实验方法

7．4．1 棉花材料的处理及获取

7．4．2 DNA及蛋白序列分析

7．4．3 载体构建

7．4．4 拟南芥及烟草叶片转化

7．4．5 棉花各组织RNA提取

7．4．6 棉纤维RNA的纯化

7．4．7 拟南芥RNA的提取

7．4．8 反转录

7．4．9 qRT-PCR

7．4．10 转基因拟南芥萌发率和绿苗率的统计分析

7．4．11 转基因拟南芥主根长度统计分析

7．4．12 组织化学染色法检测H2O2的含量

7．5 结果

7．5．1 GhMPK17基因分离鉴定

7．5．2 GhMPK17在棉花中的表达受到盐、甘露醇和ABA的诱导

7．5．3 GhMPK17蛋白亚细胞定位分析

7．5．4 GhMPK17参与ABA信号途径

7．5．5 在拟南芥中过量表达GhMPK17增强植株对盐胁迫的耐受

7．5．6 在拟南芥中过量表达GhMPK17增强植株对渗透胁迫的抗性

7．5．7 在拟南芥中过量表达GhMPK17减少植物中H2O2含量，改变与ABA及非生物胁迫相关基因的表达

7．6 讨论

结论

本文的主要创新点

参考文献

附录

博士期间发表的学术论文

致谢