靶向线粒体呼吸链复合物Ⅱ和复合物Ⅲ的新型抑制剂筛选及其抑制动力学研究

摘要

线粒体呼吸链由蛋白复合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ，泛醌，细胞色素c组成。复合物Ⅱ可催化电子由琥珀酸传至泛醌，而复合物Ⅲ是催化电子由氢醌传至细胞色素c，并且促使质子跨膜，复合物Ⅱ与复合物Ⅲ都是杀菌剂的重要靶标。 本文主要是研究复合物Ⅱ(SQR)、复合物Ⅲ(bc1)，SCR(SQR和bc1的复合酶)与抑制剂作用机制，为新型抑制剂的发现提供筛选平台，为新型杀菌剂的合理设计提供理论指导。为此我们在本论文中进行了下面的工作: 一、提取并且纯化了SCR（琥珀酸-细胞色素c氧化还原酶），并对所得到的目的蛋白进行了性质表征。 二、对复合物Ⅱ抑制剂进行筛选和动力学研究:1.吡唑类衍生物(75个化合物)中，我们引入了香豆素结构(11个化合物)，吲哚结构(40个化合物)以及苯并噁唑结构(24个化合物)。其中吲哚结构和苯并噁唑结构的引入表现出了活性，有的与对照药剂相当，有的甚至优于对照药剂;其中吲哚结构中活性最好的化合物是Y14021(IC50=0.088±0.001μM)优于对照吡噻菌胺(IC50=1.321±0.110μM)和氟唑菌酰胺(IC50=1.124±0.130μM)，而在苯并噁唑系列之中活性表现最好的化合物是Y15312(IC50=0.038±0.001μM);2.喹啉类衍生物(44个化合物)，其中活性最好的化合物是Y14166(IC50=0.010±0.001μM)，活性较对照吡噻菌胺(IC50=1.321±0.110μM)提高了130倍以上;3.噻唑双酰胺类衍生物(50个化合物)，其中绝大数的化合物没有活性，仅四个化合物在100μM的浓度下抑制率超过50％，其中活性表现较好的两个化合物分别是CC207(IC50=0.321±0.001μM)和CC209(IC50=2.757±1.192μM)，表现出进一步研究的价值;4.虚拟筛选获得的苗头化合物中D436200(IC50=36.216±1.499μM)以及化合物JFD01971(100μM下的抑制率38％)和AE-848/32004036(100μM下的抑制率46％)三个化合物成为我们进一步改造的候选化合物。 三、对复合物Ⅲ抑制剂进行筛选和动力学研究:1.噁唑菌酮衍生物(14个化合物)，将噁唑菌酮右面的苯环换成二苯醚单元时，得到活性最好的化合物Y13364(IC50=0.003±0.001μM)，优于对照药剂噁唑菌酮的活性。2.标桩菌素衍生物（共36个化合物，三种结构类型），其中化合物Y14037(IC50=0.004±0.001μM)的活性最好，与对照药剂噁唑菌酮的活性相当。3.吲唑磺菌胺衍生物(45个化合物)，其中21个化合物的活性优于对照吲唑磺菌胺，活性最好的化合物是Y14063(IC50=3.190±0.110μM)。4.苯噻菌酯衍生物(14个化合物)，且都表现出了活性，有的与苯噻菌酯(Y5247)的活性相当，有的甚至优于Y5247的活性，其中活性最好的化合物是TWL80(IC50=0.390±0.023nM)。 综上所述，本文提取并且纯化了SCR，并对其进行了性质表征。分别针对复合物Ⅱ与复合物Ⅲ的新型抑制剂进行酶活测定，动力学的表征研究。为设计、开发新型的杀菌剂先导奠定了基础。

目录

声明

摘要

第一章绪论

1．1线粒体呼吸链研究概况

1．1．1呼吸链的组成和功能

1．2酶抑制剂的抑制动力学表征方法研究

1．2．1基于抑制类型的动力学表征方法

1．2．2复合物Ⅱ和复合物Ⅲ抑制剂的动力学表征

1．3线粒体复合物Ⅱ和复合物Ⅲ及其抑制剂的研究进展

1．3．1线粒体复合物Ⅱ和复合物Ⅲ的结构及功能研究进展

1．3．2线粒体复合物Ⅱ和复合物Ⅲ抑制剂的研究进展

1．4本课题研究内容

第二章线粒体琥珀酸-细胞色素c氧化还原酶的纯化与表征

2．1引言

2．2实验器材

2．2．1主要实验仪器

2．2．2主要实验材料和试剂

2．2．3蛋白酶提取所需缓冲液和试剂

2．3实验方法

2．3．1猪心线粒体心肌的提取

2．3．2琥珀酸细胞色素c氧化还原酶的分离纯化

2．3．3琥珀酸细胞色素c氧化还原酶的表征

2．4结果与讨论

2．4．1蛋白纯化中的实验步骤及关键分析

2．4．2蛋白浓度的测定

2．4．3蛋白纯度的测定

2．4．4蛋白光谱的定性

2．5本章小结

第三章新型线粒体复合物Ⅱ抑制剂的筛选及酶抑制动力学研究

3．1引言

3．2实验部分

3．2．1实验所需仪器和材料

3．2．2实验方法

3．3线粒体复合物Ⅱ抑制剂筛选及酶抑制动力学的研究

3．3．1吡唑衍生物的筛选

3．3．2喹啉衍生物的筛选

3．3．3噻唑双酰胺衍生物的筛选

3．3．4基于虚拟筛选得到的化合物

3．3．5抑制剂筛选与酶动力学研究方法

3．4结果与讨论

3．4．1吡唑衍生物的活性测试结果及其构效关系研究

3．4．2喹啉衍生物的活性测试结果及其构效关系研究

3．4．3噻唑双酰胺衍生物的活性测试结果及其构效关系研究

3．4．4通过虚拟筛选获得的苗头化合物的活性测定

3．5本章小结

第四章新型线粒体复合物Ⅲ抑制剂的筛选及酶抑制动力学研究

4．1引言

4．2实验部分

4．2．1实验所需仪器和材料

4．2．2实验方法

4．3．2标桩菌素衍生物的筛选

4．3．3吲唑磺菌胺衍生物的筛选

4．3．4苯噻菌酯衍生物的筛选

4．3．5抑制剂筛选与酶动力学研究方法

4．4结果与讨论

4．4．1噁唑菌酮衍生物的活性测试结果及其构效关系研究

4．4．2标桩菌素衍生物的活性测试结果及其构效关系研究

4．4．3吲唑磺菌胺衍生物的活性测试结果及其构效关系研究

4．4．4苯噻菌酯衍生物的活性测试结果及其构效关系研究

4．5本章小结

第五章全文总结

参考文献

附录

研究成果及发表的论文

致谢