多形汉逊酵母表达平台改进及牛FSHα、β亚基的表达

摘要

多形汉逊酵母(Hansenulapolymopha)是近几年发展起来的作为真核细胞表达外源基因的一种甲醇酵母。我们利用本实验室已有的汉逊酵母表达平台，将其进行改造，将来自汉逊酵母的25SrDNA、18SrDNA构建到表达载体中，以提高外源基因拷贝数，并且利用汉逊酵母tRNA的丰富度及汉逊酵母密码子的偏爱性设计不同的目的基因序列，以此来提到外源基因的表达量。通过报告基因绿色荧光蛋白(Modifiedgreenfluorescentprotein，mGFP5)和荧光素酶蛋白(fireflyluciferaseprotein,Luc)表明，我们所用的载体都完全可以在多形汉逊酵母中进行有效表达外源真核基因，而且保持天然蛋白的活性和特性，25SrDNA可以提高目的基因拷贝数，从而提高目的基因的表达量。 我们根据牛的促卵泡激素(FollicleStimulatingHormone，FSH)α亚基的cDNA序列合成了FSHα亚基的原始基因，同时又根据汉逊酵母tRNA的丰富度及汉逊酵母的密码子的偏爱性分别设计合成了FSHα亚基片段；根据Genbank报道的牛的促卵泡激素(FSH)β亚基cDNA序列合成了FSHβ亚基的原始基因片段。并将上述片段分别连到已构建的汉逊酵母表达载体pHFMD-Z-alpha-A上在汉逊酵母中进行了分泌表达，采用Ni+柱亲和层析，用ELISA检测和Westernblot分析表明，根据汉逊酵母tRNA的丰富度设计的牛FSHα亚基cDNA基因和原始β亚基cDNA基因完全可以在汉逊酵母中表达，且FSHα亚基的表达量达2mg/L。将FSHα亚基构建到带有25SrDNA的表达载体pHFMD-Z-alpha-A上与不带5SrDNA的表达载体pHFMD-Z-alpha-A上在汉逊酵母中进行诱导表达，结果发现带有25SrDNA的转化子的表达量明显高于不带25SrDNA的转化子。我们还比较了用甘油与甲醇做诱导剂的表达差异性，发现甲醇诱导远远优于甘油诱导。本实验首次实现了促卵泡激素α亚基和β亚基在汉逊酵母中的表达，为实现牛促卵泡激素全蛋白在汉逊酵母表达中表达打下了基础。同时为其它基因实现在汉逊酵母中表达及在提高拷贝数等方面提供了新的思路。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：简略表

独创性声明及关于论文使用授权的说明

前 言

第一部分多形汉逊酵母表达平台的改进

第二部分 牛促卵泡激素α亚基在多形汉逊酵母中的表达

第三部分 牛促卵泡激素β亚基在多形汉逊酵母中的表达

总结

参考文献

附录

攻读硕士学位期间论文发表情况

致谢