Dynamitin调控雄性果蝇生殖和幼虫发育的机制研究

摘要

Dynamitin(Dmn)又名DCTN2-p50，该基因编码动力蛋白激活蛋白(dynactin)的核心亚基Dmn，Dmn是dynactin复合体聚合以及连接Arp1纤维和侧臂的关键因子，同时也是dynactin复合体与动力蛋白(dynein)和微管(tubulin)蛋白相连接的重要结构。细胞中许多运动事件都是通过dynein-dynactin复合体来进行调节的。
　　研究组已有研究结果显示:一种内共生菌Wolbachia感染，导致果蝇产生细胞质不亲和(CI)表型，即感染Wolbachia的雄性果蝇与未感染或者感染不同品系Wolbachia的雌性果蝇进行交配时，后代胚胎成活率显著降低或没有后代存活。为了深入探究果蝇感染Wolbachia引起CI的分子机理，研究组通过microarry技术检测了未感染和感染Wolbachia的三龄幼虫精巢中基因表达情况，共鉴定到296种差异表达的基因（差异倍数均在1.5倍以上），其中167个基因表达量上调，129个基因表达量下调。研究组还通过比较蛋白组学，研究了与感染和未感染Wolbachia的1日龄雄性交配2h后雌性受精囊和纳精囊中的差异表达蛋白，鉴定到了83个差异表达的蛋白。在microarry和蛋白组学检测中，Dmn表达量在Wolbachia感染后均呈下调趋势，暗示其可能在雄性果蝇的生殖过程中起重要作用，因此选用RNAi干扰品系，用UAS/Gal4系统驱动Dmn在果蝇中特异性敲降，以研究Dmn在雄性果蝇繁殖过程中的作用及与CI的关系。
　　首先通过荧光定量RT-PCR(qRT-PCR)的方法，验证了Wolbachia感染对果蝇精巢中Dmn表达的影响，结果发现，wMel Wolbachia感染确实引起果蝇精巢内Dmn表达量极显著下调(P＜0.01)。然后，通过用UAS/Gal4系统，选用nosGal4驱动Dmn在果蝇性腺中敲降，探究Dmn在雄性果蝇繁殖过程中的作用。选取了两个Dmn的干扰品系（干扰序列有差异）:Dmn-hp-1和Dmn-hp-2，与nosGal4/TM6B处女蝇交配，得到Dmn在精巢中敲降的雄蝇nosGal4/Dmn-hp-1和nosGal4/Dmn-hp-2。再用Dmn在精巢中敲降的雄蝇与野生处女蝇交配后，统计胚胎的孵化率，结果显示，胚胎孵化率分别为28.97±4.14％和42.34±4.40％，均极显著低于对照组的90.64±3.32％，产生了类似Wolbachia感染引起CI的表型。这一结果说明，Wolbachia感染引起果蝇精巢内Dmn表达量极显著下调，可能是Wolbachia感染引起CI的原因之一。为进一步研究Dmn在Wolbachia感染的果蝇精巢内表达量下调是否与CI相关，在Wolbachia感染的果蝇精巢内过量表达Dmn，看其是否能挽救雄果蝇的育性，结果发现，在Wolbachia感染的果蝇精巢内过量表Dmn后，确实能够挽救雄果蝇的育性，其子代胚胎孵化率恢复至77.84％，表明Wolbachia感染引起果蝇精巢内Dmn表达量下调，确实是引起CI的原因。
　　为了研究Dmn影响雄性果蝇育性的机制，采用免疫组化和透射电镜技术对Dmn敲降精巢中精子发生过程进行分析（后续研究都用的是Dmn-hp-1品系）。DAPI染色显示，与对照组相比，Dmn敲降精巢前端比较膨大，精巢基部精子束较少，且精子核浓缩程度低，在精子束周围，还散布一些处于独木舟阶段的精细胞。在精巢末端，对照组分布有核高度浓缩成针形的精子，而在Dmn敲降组精子核还没有高度浓缩就从包囊中脱离出来。在最后的储精囊中，对照组充满成熟的精子，而Dmn敲降组中精子较少，大约为对照组的40％，这表明Dmn在精巢中敲降破坏了精子发生过程，降低了精子的产生量，可能因而降低了雄性果蝇的育性。
　　正常条件下，在果蝇精子发生的第二次成熟分裂末期，线粒体聚集、融合，将发育为线粒体衍生物，进而发育为副核(nebenkern)。透射电镜结果显示:在第二次成熟分裂末期，对照组精细胞中有许多线粒体聚集在一起，其中部分线粒体已开始融合，而Dmn敲降组精细胞中线粒体较少，且没有聚集。之后，在精母细胞经过2次成熟分裂形成64个圆形精细胞的包囊中，对照组精细胞排列整齐有序，每一个精细胞有一个大的线粒体衍生物靠近一个轴丝，而在Dmn敲降组精细胞的包囊中，精细胞排列较为混乱，经常发现精细胞膜融合的现象，在一个细胞膜内有多个轴丝——线粒体对，也观察到有多个线粒体衍生物伴随一个轴丝的现象。在精子伸长阶段，在对照组包囊横切面上可以观察到，每一个精子都包含一个副核伴随一个轴丝，排列方向一致，而在Dmn敲降组中，精子排列无序，有时可以观察到，两对轴丝——线粒体通过两个连在一起的小的线粒体衍生物连在一起，部分副核没有高度浓缩。在精子个体化阶段，Dmn敲降组精细胞的包囊膜迅速内陷，包囊中部分精子发生退化，这可能是未成熟精子过早从包囊中释放且精子数量少的原因。
　　抗体染色显示，Dmn在雄性生殖干细胞中没有表达。当生殖干细胞开始分化，经过四轮同步分裂形成16个精原细胞组成包囊时，Dmn开始表达。在对照组精母细胞分裂的前中期，在星状体微管和纺锤体的两极Dmn信号较强，在着丝粒处也有Dmn的表达，在这个过程中，dynein几乎与Dmn共定位。而在Dmn敲降组精母细胞分裂的前中期，Dmn的信号强度显著低于对照组(P＜0.05)。随着精子的成熟，Dmn和dynein的信号逐渐减弱，最后消失，说明它们可能与多余的细胞质一起被排出精子之外。Dmn敲降也导致精细胞中dynein和tubulin表达下降，这也可能是精子不能正常形成的原因。
　　精子发生的最后步骤就是个体化过程和成熟精子的卷曲。个体化过程通过形成个体化复合体(individualization complex，IC)来完成。IC由64个环绕针状精核的肌动蛋白(F-actin)椎体组成。在个体化过程中，IC从精子头部沿着轴丝向精子尾部运动，去除多余的细胞质和细胞器，每个精子之间形成新的细胞膜，完成精子个体化过程，形成独立的有活力的成熟精子。在Dmn敲降精巢中，精子束结构分散，且大部分精子束没有形成完整有序的个体化复合体，在精巢中有散乱的F-actin分布。另外，与对照组相比，在Dmn敲降精巢中，个体化复合体沿着精子束移动的速度较慢，精子仍处于个体化的初期状态，仍有部分精子束没有个体化复合体形成。这一结果表明，Dmn可调控F-actin的聚集以及IC的形成，因而影响精子个体化过程。
　　由于Dmn敲降产生的部分表型与Lis-1、Spag4、Yuri、Ddlc1、DCTN1-p150和ATPsys-b等基因突变引起的表型相似，又通过qRT-PCR的方法检测Dmn敲降对这些基因表达的影响，结果显示，Dmn在果蝇精巢中敲降也引起这些基因在精巢中的表达显著下调。为了研究这些基因是否与Dmn相互作用，选择了Ddlc1（编码果蝇的Dynein轻链）进行进一步探索。将Ddlc1在Dmn敲降的果蝇精巢中过量表达，检测其是否能挽救由于Dmn敲降引起雄性果蝇育性下降的表型。结果发现，Ddlc1在Dmn敲降的果蝇精巢中过量表达的确能够挽救由于Dmn敲降引起雄性果蝇育性缺陷，子代胚胎孵化率恢复至89.95±2.73％。因此，Dmn基因的确与这些精子发生相关基因之间存在相互作用关系，共同调控果蝇的精子发生过程。
　　还选用actGal4驱动Dmn在果蝇全身广泛敲降，来探究Dmn在果蝇发育过程中作用。结果显示，Dmn在果蝇全身广泛敲降后，导致敲果蝇只能发育至幼虫阶段，不能化蛹，并最终在幼虫期死亡。根据相关文献报道，影响果蝇幼虫发育的信号通路主要是保幼激素信号通路和蜕皮激素信号通路。在本研究中，对幼虫的蜕皮情况进行观察，结果发现，Dmn全身广泛敲降的幼虫蜕皮情况与对照组差异不显著，因此，推测，Dmn敲降后可能影响了保幼激素信号通路。因此，检测了与保幼激素相关的基因JhI-26、Met和Kr-h1在Dmn全身广泛敲降的幼虫中的表达量。结果显示，3个基因的表达量均发生显著上调。因此，推断，Dmn对幼虫生长的影响是通过调控与保幼激素相关的基因JhI-26、Met和Kr-h1上调表达来诱导保幼激素过度表达，使幼虫不能化蛹。
　　综上所述，Dmn不仅在精子发生过程中发挥重要的调控作用，而且在调控幼虫的生长发育过程中也有重要的功能。本研究还发现，Wolbachia感染引起果蝇精巢中Dmn表达下调，是Wolbachia诱导昆虫产生CI的机制之一。这不仅为精子发生的调控机制的研究提供了新的思路，而且由于果蝇的精子发生和人类的精子发生有很多相似之处，本研究也能够为研究男性不育机制提供一定的基础资料。

目录

声明

摘要

第一章 文献综述

1．1 Dmn的结构与功能

1．2 果蝇精子发生过程

1．2．1 精子发生的早期

1．2．2 圆形精子延长

1．2．3 精子经历个体化过程，形成成熟精子

1．3 果蝇精子发生相关基因的研究进展

1．3．1 精子发生早期相关基因及其作用机制

1．3．2 精子延长期相关基因及其作用机制

1．3．3 精子个体化时期相关基因及其作用机制

1．4 果蝇及幼虫的发育机制

1．4．1 果蝇的发育过程

1．4．2 果蝇幼虫的发育过程

1．4．3 影响果蝇幼虫发育的机制

1．5 Wolbachia对果蝇生殖的影响

1．5．1 Wolbachia的生物学特性及感染特点

1．5．2 Wolbachia对果蝇生殖的影响

1．6 本研究的目的及意义

第二章 Wolbachia感染引起Dmn下调是果蝇产生CI的机制之一

2．1 前言

2．2 材料与方法

2．2．1 果蝇品系及饲养方法

2．2．2 果蝇精巢解剖及RNA提取、逆转录成cDNA

2．2．3 qRT-PCR

2．2．4 果蝇DNA的提取

2．2．5 果蝇胚胎孵化率统计

2．2．6 单个雄蝇产生后代数统计

2．2．7 统计分析方法

2．3 结果与分析

2．3．2 Dmn敲降效果检测

2．3．3 Dmn在精巢中敲降后雄性繁殖力极显著下降

2．3．4 Dmn基因在感染Wolbachia的雄蝇中过表达效果检测

2．3．5 Dmn基因过表达能够挽救感染Wolbachia引起的雄性育性缺陷

2．4 讨论

第三章 Dmn在精巢中敲降后影响精子发育的机制研究

3．1 前言

3．2 材料与方法

3．2．1 果蝇精巢DAPI染色

3．2．2 果蝇精巢透射电镜超薄切片制备

3．2．3 果蝇精巢免疫组化实验

3．2．4 果蝇精巢的解剖和RNA提取及反转录成cDNA

3．3 结果与分析

3．3．1 Dmn在精巢中敲降后破坏精子发生过程

3．3．2 Dmn在精巢中敲降后影响线粒体聚集及副核的形成

3．3．3 Dmn在精子发生过程早期表达，并与dynein共定位

3．3．4 Dmn在精巢中敲降后影响dynein和tubulin在糟核周围的聚集

3．3．5 Dmn在精巢中敲降后破坏个体化复合体(IC)和核柬的形成

3．4 讨论

第四章 Dmn与其他精子发生相关基因的相互作用

4．1 前言

4．2 材料与方法

4．2．1 果蝇品系及饲养

4．2．2 果蝇杂交方法

4．2．3 果蝇精巢解剖及RNA提取

4．2．4 果蝇胚胎孵化率统计

4．3 结果与分析

4．3．1 Dmn在精巢中敲降后影响精子发生相关基因的表达

4．3．2 Dmn敲降雄蝇中Ddlc1过表达效果检测

4．3．3 Dmn敲降雄蝇Ddlc1过表达后挽救了Dmn敲降雄蝇的育性缺陷

4．4 讨论

第五章 Dmn全身广泛敲降后抑制果蝇幼虫的发育

5．1 前言

5．1．1 果蝇幼虫的发育

5．1．2 影响果蝇幼虫发育的信号通路

5．1．3 本章研究的目的及意义

5．2．2 Brdu标记实验

5．2．3 果蝇幼虫生长和蜕皮情况观察

5．2．5 qRT-PCR检测与保幼激素相关基因Met、JhI-26和Kr-h1表达量

5．3 结果与分析

5．3．2 Dmn全身广泛敲辟后影响幼虫的发育和蜕皮

5．3．3 Dmn全身广泛敲降后通过影响幼虫中肠和脑的发育来影响幼虫生长

5．3．4 Dmn全身广泛敲降后通过影响保幼激素信号通路相关基因JhI-26、Met和Kr-h1表达影响幼虫发育

5．4 讨论

第六章 小结

参考文献

论文发表情况

致谢