不同种群甘薯茎线虫对乙酰胆碱酯酶抑制剂的敏感性差异及机理

摘要

乙酰胆碱酯酶(acetylcholinesterase，AChE)是有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂作用的主要靶标部位，它们通过抑制AChE对乙酰胆碱的水解作用，干扰和最终阻断突触传导。有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂的广泛使用已经导致许多害虫产生了明显的抗药性。近年来，在我国一些地区采用涕灭威防治甘薯茎线虫(Ditylenchus destructor)，其效果呈现下降的趋势。为此，本文以甘薯茎线虫为研究对象，采集了河北省不同种群，进行了毒力生测、乙酰胆碱酯酶活力测定、甘薯茎线虫乙酰胆碱酯酶三个基因cDNA全长的克隆、抗药性种群的汰选，以及利用实时荧光定量PCR检测了不同种群各乙酰胆碱酯酶基因的相对表达水平，明确了当前甘薯茎线虫对乙酰胆碱酯酶抑制剂的抗性水平，探讨了抗性机理，证实了甘薯茎线虫抗药性的产生与乙酰胆碱酯酶的过量表达相关。具体研究结果如下： 1、采用浸渍法和沙柱法对河北省昌黎、涿州、卢龙和抚宁四地的甘薯茎线虫进行了涕灭威、灭线磷、阿维菌素的敏感性测定。浸渍法结果表明，昌黎甘薯茎线虫种群对涕灭威、灭线磷的LC<,50>分别为891.73mg/L、743.82mg/L，其它三地涿州、卢龙和抚宁甘薯茎线虫种群对涕灭威、灭线磷的敏感性均有所降低，与昌黎种群相比较，其对涕灭威的抗性倍数分别为4.0、3.5和3.7倍，对灭线磷的抗性倍数分别为3.8、2.1和1.6倍；阿维菌素在400 mg/L以下时，各种群的死亡率均在45％以下，为600 mg/L时其死亡率陡增，均为90％以上，且无显著性差异。沙柱法结果表明，5mg/L的涕灭威和50mg/L的灭线磷对线虫的活动能力具有很好的抑制作用，50mg/L的阿维菌素抑制作用则相对较低。 2、在对不同温度和盐浓度的适应性测定发现，昌黎种群较其它三地种群对46℃以下的高温有较高的耐受力；抚宁种群对盐具有较高的耐受力，卢龙和昌黎两种群线虫对盐的耐受力较低。不同的地理生态环境使线虫具不同的特殊生态适应性。 3、用改进的Ellman方法测定了河北省昌黎、涿州、卢龙和抚宁四个不同种群甘薯茎线虫的乙酰胆碱酯酶的生化特性及其对抑制剂涕灭威和毒扁豆碱的敏感性差异。结果表明：甘薯茎线虫AChE至少存在两种类型，一种类型对毒扁豆碱的IC<,50>值小于10<'-6>mol/L，另一种类型大于10<'-4> mol/L。当抑制剂毒扁豆碱浓度为10<'-6>～10<'-10> mol/L、涕灭威浓度为10<'-5>～10<'-10> mol/L时，甘薯茎线虫昌黎种群AChE的敏感性抑制率明显高于涿州、抚宁、卢龙三地的甘薯茎线虫种群的AChE的抑制率。各地种群AChE对抑制剂敏感性差异是由于甘薯茎线虫AChE的多态性和各分子型综合性改变的结果。 4、利用RT-PCR结合RACE技术首次克隆了甘薯茎线虫乙酰胆碱酯酶基因cDNA全序列：Dd-ace-1、Dd-ace-2和Dd-ace-3，提交GenBank登录号分别是EF583059、EF583058和EF583057。其长度分别是2196bp、2425bp和2517bp。这三个ace基因5’端均存在反式剪接引导序列SL1。其中Dd-ace-1编码635个氨基酸，Dd-ace-2编码734个氨基酸，Dd-ace-3编码611个氨基酸。克隆的三个基因都具有乙酰胆碱酯酶的特征：催化三联体、胆碱结合位点、3对分子内二硫键桥和保守的芳香族氨基酸残基等。聚类分析显示，Dd-ACE-1、Dd-ACE-2、Dd-ACE-3分别与其它线虫乙酰胆碱酯酶ACE-1、ACE-2、ACE-3同属一个支系。 5、采用实时荧光定量PCR技术比较了河北省昌黎、涿州、卢龙和抚宁四地的甘薯茎线虫AChE基因Dd-ace-1，Dd-ace-2和Dd-ace-3的mRNA表达水平的差异。涿州、卢龙和抚宁三地种群的ace-1、ace-2和ace-3在转录水平上不同程度的高于昌黎种群。涿州、卢龙和抚宁三地种群AChE敏感性降低与ace-1、ace-2、ace-3多基因的过量表达相关。 6、采用沙柱法对敏感种群进行涕灭威、灭线磷和阿维菌素抗药性汰选，进一步证实了涕灭威、灭线磷能显著提高甘薯茎线虫ace-1、ace-2、ace-3基因mRNA的表达水平，但这种量的变化不足以显著提高汰选种群的抗药性，但可以观察到不同药剂汰选种群在含药剂或不含药剂的沙柱中的运动情况有所变化。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章文献综述

1 AChE催化部位及晶体结构

1.1 AChE的三维结构

1.2 AChE的功能位点

1.3芳香族引导(aromatic guidance)机制

1.4后门开放(backdoor opening)机制

2线虫AChE研究概况

2.1线虫AChE的分子型(molecular forms)

2.2线虫AChE的药理学特性

2.3线虫AChE的基因结构、功能和组织分布

3与乙酰胆碱酯酶相关的抗药性机理研究进展

3.1 AChE的量变与抗药性

3.2 AChE的突变与抗药性

第二章 不同种群甘薯茎线虫对不同类型杀线剂的敏感性及对不同盐浓度、温度的适应性研究

1材料与方法

1.1供试药剂

1.2供试甘薯茎线虫

1.3生物测定方法

1.4对不同温度的适应性

1.5对不同盐浓度的适应性

2结果与分析

2.1不同类型药剂处理甘薯茎线虫后中毒症状的观察

2.2不同种群对不同类型药剂的敏感性

2.3不同种群在不同浓度涕灭威、灭线磷和阿维菌素沙柱的移动情况

2.4不同种群甘薯茎线虫对温度的适应性

2.5不同种群甘薯茎线虫对盐的适应性

3讨论

第三章不同种群甘薯茎线虫乙酰胆碱酯酶对抑制剂的敏感性

1材料与方法

1.1材料

1.2方法

2结果与分析

2.1不同种群总AChE比活力测定结果

2.2毒扁豆碱、涕灭威对不同种群甘薯茎线虫总AChE的影响

2.3毒扁豆碱对不同地理甘薯茎线虫种群不同AChE分子型的影响

3讨论

第四章甘薯茎线虫乙酰胆碱酯酶基因ace-1、ace-2和ace-3全长cDNA的克隆和序列分析

1材料与方法

1.1材料

1.2主要试剂和仪器

1.3实验方法

2结果与分析

2.1 RNA的提取结果

2.2甘薯茎线虫乙酰胆碱酯酶基因ace-1全长cDNA的克隆及序列分析

2.3甘薯茎线虫乙酰胆碱酯酶基因ace-3全长cDNA的克隆及序列分析

2.4甘薯茎线虫乙酰胆碱酯酶基因ace-2全长cDNA的克隆及序列分析

3讨论

3.1关于甘薯茎线虫乙酰胆碱酯酶ACE-1

3.2关于甘薯茎线虫乙酰胆碱酯酶ACE-2

3.3关于甘薯茎线虫乙酰胆碱酯酶ACE-3

3.4关于活性中心丝氨酸的编码

3.5关于甘薯茎线虫ACE部分保守位点的变化

3.6关于反式剪接引导序列

第五章Dd-ace-1、Dd-ace-2和Dd-ace-3基因在不同种群甘薯茎线虫mRNA表达水平的差异

1材料与方法

1.1材料

1.2方法

2结果与分析

2.1内标基因引物的确定

2.2荧光定量PCR产物熔解曲线分析及扩增效率的确定

2.3 ace-1、ace-2、ace-3基因表达量的检测结果

3讨论

第六章不同类型杀线剂对甘薯茎线虫的抗药性选育及其转录水平的差异性

1.材料与方法

1.1 虫源

1.2药剂

1.3抗药性种群的选育方法

1.4药剂汰选种群mRNA表达水平的测定

2结果与分析

2.1涕灭威的抗药性种群选育

2.2灭线磷的抗药性种群选育

2.3阿维菌素的抗药性种群选育

2.4各药剂对药剂选育种群的毒力

2.5不同汰选种群ace-1、ace-2、ace-3基因表达量的检测结果

3讨论

全文结论

参考文献

致谢

作者简历