三（β-氯乙基）磷酸酯对小鼠学习与记忆的影响及其机制研究

摘要

三（β-氯乙基）磷酸酯(Tris(β-chloroethyl)phosphate，简称TCEP）因具有良好的阻燃兼增塑性能，广泛用于各种生活制品中，如家具、电子产品、食品包装以及建筑材料等，有效提高产品的安全性能。TCEP作为添加剂与材料以非共价键方式结合，经磨损和挥发进入周围环境，再通过呼吸和饮食等方式进入机体并在生物体内富集。已有研究表明，TCEP具有一定的致癌性，可导致氧化应激、内分泌功能失调以及生殖和发育异常等。此外，还有研究发现大鼠长时间暴露于高剂量TCEP后，大脑海马CA1区神经元缺失。然而，海马与学习记忆功能密切相关，TCEP对学习与记忆的影响及其机制有待进一步研究。
　　本研究以雄性昆明小鼠为对象，探讨TCEP对小鼠学习与记忆功能的影响及其潜在机制。我们首先每天通过灌胃给予小鼠不同剂量(75 mg/kg或150 mg/kg) TCEP处理3周，即75 mg/kg TCEP组和150 mg/kg TCEP组;或给予150 mg/kg TCEP处理1周后再给予20 mg/kg TubastatinA（简称TBSA）共同处理2周，即TCEP+TBSA组;同时，对照组给予这两种药物的溶剂处理。药物处理之后，我们再利用行为学实验，如Morris水迷宫、新异物体识别实验和电跳台实验检测TCEP及TBSA对小鼠学习与记忆能力的影响，并进一步通过免疫组化和免疫印迹探究其潜在分子机制。结果发现:(1)75 mg/kg TCEP、150 mg/kg TCEP及20 mg/kg TBSA处理后，小鼠未出现急性反应且各组间小鼠平均体重无明显差异。(2)在Morris水迷宫中:定位航行实验阶段，与对照组相比，75 mg/kg TCEP组的逃避潜伏期明显延长（第2天，p＜0.05;第5天，p＜0.05）;150 mg/kg TCEP组的逃避潜伏期明显延长（第4天，p＜0.05;第5天，p＜0.001）;TCEP+TBSA处理组较150 mg/kg TCEP组，逃避潜伏期明显缩短（第4天，p＜0.01;第5天，p＜0.05）。在空间探索实验阶段:与对照组相比，150 mg/kg TCEP组的目标象限停留时间(p＜0.05)和穿越平台次数(p＜0.05)均明显降低;而TCEP+TBSA处理组较150 mg/kg TCEP组的目标象限停留时间(p＜0.05)和穿越平台次数(p＜0.05)均明显增加;两TCEP处理组小鼠寻找隐藏平台的游泳轨迹无目的性，杂乱。由此，表明TCEP诱导小鼠空间学习与记忆发生障碍。(3)新异物体识别实验:与对照组相比，150 mg/kg TCEP组探索总时间稍有增加(p＜0.05);与对照组相比，TCEP组的探索新异物体的时间均显著减少（75 mg/kg TCEP组，p＜0.05;150 mg/kg TCEP组，p＜0.05），表明TCEP处理引起小鼠新异识别记忆异常。(4)电跳台实验:与对照组相比，两TCEP处理组跳台潜伏期均显著降低（75mg/kg TCEP组，p＜0.05;150 mg/kg TCEP组，p＜0.05），同时错误次数均显著增加(p＜0.05)，表明TCEP诱导小鼠情绪性记忆下降。(5)我们先通过免疫印迹检测TCEP处理对Akt/GSK-3β信号通路的影响，发现这两种总蛋白无明显差异，但其磷酸化水平有差异。两TCEP组的p-Akt(Ser473)均明显降低（75 mg/kg TCEP组，p＜0.05;150 mg/kg TCEP组，p＜0.001），以及150mg/kg TCEP组的p-GSK-3β(Ser9)明显降低(p＜0.05)，表明TCEP处理可通过磷酸化作用调控Akt/GSK-3β信号通路。(6)不同处理组的HDAC6蛋白水平无明显差异，进一步检测对HDAC6下游底物微管蛋白(α-tubulin)的乙酰化程度影响。与对照组相比，150 mg/kg TCEP组的ac-tubulin水平显著降低(p＜0.05)，而TCEP+TBSA组较150 mg/kg TCEP组明显增加。我们再通过免疫组化观察海马CA1区锥体细胞内的轴突微管，观察到对照组微管较长且整齐;75 mg/kg TCEP组的微管较少、缩短且杂乱，150 mg/kgTCEP组的微管解聚呈点状，且TCEP+TBSA处理组较150 mg/kgTCEP组的微管解聚情况有所改善，提示TCEP处理导致微管解聚、缩短甚至崩解。(7)与记忆密切相关的突触蛋白表达:与对照组相比，两TCEP组的Synapsin-1蛋白水平明显降低（75 mg/kg TCEP组，p＜0.05;150 mg/kg TCEP组，p＜0.05）;150 mg/kg TCEP组的PSD-95明显降低(p＜0.05);且TCEP+TBSA组较150 mg/kgTCEP组有所增加。我们进一步通过免疫组化观察上述两种蛋白质在海马区域的表达情况，与对照组相比，两TCEP组的Synapsin-1在CA1和CA3染色均变浅;且PSD-95在CA3区染色变浅，进一步说明TCEP处理引起海马内此类蛋白水平降低，且TCEP+TBSA组较150mg/kg TCEP组的染色均加深，表明该区的蛋白表达增加。
　　以上结果表明:TCEP处理诱导小鼠空间学习与记忆、新异识别记忆及情绪性记忆功能异常，而TBSA处理可显著改善小鼠上述行为学障碍。Akt/GSK-3β信号通路、HDAC6、微管稳定性、突触蛋白在TCEP诱导的认知障碍中发挥潜在作用。
　　本研究期望为TCEP的环境预警策略提供新信息，以及TCEP的神经毒性尤其是对中枢神经系统相关的学习与记忆功能的损伤提供一定实验依据，并进一步为Tubastatin A在此类治疗中的应用提高参考。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 有机磷阻燃剂与三(β-氯乙基)磷酸酯的介绍

1．2 海马与学习记忆功能

1．3 Akt／GSK-3β信号通路

1．3．1 Akt的结构及功能调节

1．3．2 GSK-3β的结构及功能

1．4 组蛋白去乙酰化酶6

1．4．1 HDAC6的结构和功能

1．4．2 HDAC6活性升高对微管的影响

1．5 记忆相关突触蛋白对认知功能的影响

1．6 本课题研究意义

2．1 实验动物与分组

2．2 实验动物处理

2．3 主要试剂、抗体和仪器

2．3．1 试剂

2．3．2 抗1本

2．3．3 主要仪器

2．4 行为学实验方法及过程

2．4．1 Morris水迷宫检测小鼠空间学习与记忆功能

2．4．2 新异物体识别实验检测小鼠新异物体识别记忆能力

2．4．3 电跳台实验检测小鼠的情绪性记忆能力

2．5 免疫组化

2．5．1 心脏灌流固定小鼠脑组织

2．5．2 振荡切片

2．5．3 免疫组化

2．6 海马蛋白样品制备

2．7 BCA法测定蛋白浓度并制备电泳样品

2．8 免疫印迹

2．9 数据分析

3．结果

3．1 TCEP及TBSA处理对小鼠空间学习与记忆能力的影响

3．2 TCEP及TBSA处理对小鼠新异识别记忆能力的影响

3．3 TCEP及TBSA处理对小鼠情绪性记忆能力的影响

3．4 TCEP及TBSA处理对小鼠海马内p-Akt和p-GSK-3β蛋白水平的影响

3．5 TCEP及TBSA处理对小鼠海马内HDAC6蛋白水平及α-tubulin的乙酰化程度的影响

3．6 TCEP及TBSA处理对小鼠海马内记忆相关突触蛋白PSD-95和Synapsin-1的影响

4 讨论

4．1 TCEP处理对学习与记忆功能的损伤作用

4．2 Akt／GSK-3β信号通路参与TCEP诱导的小鼠学习与记忆障碍

4．3 TCEP处理导致HDAC6活性增加及Tubasatin A的保护作用

5 小结

参考文献

附录

致谢