苏云金芽胞杆菌酪氨酸酶基因的克隆、表达及应用初探

摘要

酪氨酸酶基因(mel)编码的酪氨酸酶是生物体合成黑色素的关键酶.该酶催化底物L-酪氨酸形成L-多巴,并经一系列氧化过程合成黑色素.黑色素具有多种重要的生理功能,特别是其抗紫外线,清除自由基的功能和应用价值倍受关注.由前人的研究结果已知苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)在酪素培养基42℃条件下产生可溶性棕黑色黑色素的基础上,首先对该室保藏的近120余株苏云金芽胞杆菌,其中包含约80个亚种和血清型,进行了产黑色素的普查.结果表明,约50﹪测试菌株均在酪素培养基42℃高温诱导下产生黑色素,产生黑色素的时间和浓度随菌株不同而有所差别.在NCBI网站上比较已克隆的各种生物酪氨酸酶蛋白质氨基酸序列,得到其保守结构域的区段(编号pfam00264.8),将该区段氨基酸序列在部分已测序的蜡状芽胞杆菌ATCC10987总基因组中进行tblastn分析,结果得到相似性最大的一段2.5kb的DNA序列.由于有人将苏云金芽胞杆菌和蜡状芽胞杆菌已报道的基因序列进行比较发现二者的相似性高达98﹪,因此根据该2.5kb的DNA序列设计引物从苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis 4D11)中扩增得到了包含酪氨基酸酶基因的1.2kb大小的DNA片段.通过引物引入的SacI和BamHI酶切位点将该片段亚克隆到载体pGEM-7zf上获得重组质粒pBMB1179.将它转入大肠杆工力DH5α,所得到的转化子EMB1179在添加了0.1﹪L-酪氨酸的LB培养基中37℃培养16小时后能明显合成可溶性的黑色素.将如上条件下培养的EMB1179制备蛋白质样品并进行SDS-PAGE电泳,结果得到与预期酪氨酸酶分子量大小一致的约28.5KD的特异蛋白质条带.测定重组菌株EMB1179黑色素的产生随时间变化曲线.结果表明,黑色素在菌体培养前6h内生成量不大,在6~18h内生成量逐渐增大,到18h达到峰值.与此同时,将EMB1179在酪素摇瓶37℃培养36h后在300nm紫外光下进行照射,根据菌体存活率的大小,断定给该mel基因产生的黑色素确定能在一定程度上保护菌体免受紫外辐射.利用PCR片段重叠延伸连接技术(SOE),将苏云金芽胞杆菌酪氨酸酶基因的编码区前端加和苏云金芽胞杆菌芽胞非依赖型强启动子pro3Aα,通过扩增引入的SphI和SacI酶切位点将此融合片段构建到穿梭载体pHT3101上获得重组质粒pHTPM.将此重组质粒电转化至苏云金芽胞杆菌无晶体突变受体菌株BMB171,得到转化子BMBPM.在30℃酪素培养基中,重组菌重组菌BMBPM已经能够合成黑色素,但其生成量并没有提高.SDS-PAGE结果表明,酪氨酸酶基因确实已经表达.推测可能是由于细胞内的阻遏效应或30℃低温抑制了酶活所致.

目录

摘要

Abstract

1.前言

1.1黑色素的研究进展

1.1.1黑色素的结构及性质

1.1.2合成黑色素的相关酶类

1.1.3编码酪氨酸酶的基因

1.1.4黑色素的生物合成途径

1.1.5黑色素的结构特征和功能

1.1.6黑色素在生物系统中的功能

1.2苏云金芽胞杆菌防紫外辐射制剂和剂型的研究进展

1.2.1苏云金芽胞杆菌制剂的紫外线失活

1.2.2苏云金芽胞杆菌的紫外线失活机理

1.2.3苏云金芽胞杆菌制剂的紫外防护剂

1.3苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白基因的启动子和上游区

1.3.1芽胞依赖型启动子

1.3.2芽胞非依赖型启动子

2.研究目的

3.材料和方法

3.1材料

3.1.1质粒和菌株

3.1.2菌体的培养

3.2试剂与仪器

3.2.1试剂

3.2.2仪器

3.3方法

3.3.1大肠杆菌质粒DNA的提取

3.3.2苏云金芽胞杆菌质粒的提取

3.3.3苏云金芽胞杆菌总DNA的抽提

3.3.4 DNA的电泳分析

3.3.5 DNA片段的回收

3.3.6 PCR 扩增

3.3.7大肠杆菌的常规转化

3.3.8苏云金芽胞杆菌的电转化

3.2.9大肠杆菌转化子的快检

3.3.10菌体总蛋白样品的制备

3.3.11 SDS-PAGE凝胶的制备

3.3.12电泳、染色及脱色

3.3.13黑色素含量的测定

3.3.14菌体存活力的计算

3.3.15 SOE法构建融合基因

4.结果与分析

4.1苏云金芽胞杆菌诱导产黑色素验证

4.2 mel基因的克隆及表达

4.3基因的序列分析

4.4酪氨酸酶蛋白的SDS-PAGE电泳

4.5重组菌株黑色素生成量的测定

4.6重组菌株经紫外照射后菌体存活率的测定

4.7黑色素在苏云金芽胞杆菌中的高效表达

4.7.1带有pro3Aa启动子的酪氨酸酶基因的构建

4.7.2 mel基因在苏云金芽胞杆菌中的表达

5.讨论

6.小结

参考文献

缩略语表

致谢