马铃薯块茎低温糖化机理及转化酶抑制子基因的克隆与功能鉴定

摘要

马铃薯是世界第四大粮食作物，用途广泛，其加工产品薯片和炸薯条是风靡全球的食品。为了抑制常温贮藏产生的块茎失水皱缩、病害传播、发芽等现象及延长加工周期，常将马铃薯块茎贮藏在低温条件下。但低温常使块茎中的淀粉加速转化为还原糖，高温油炸加工时，还原糖与块茎中游离的氨基酸发生反应，严重影响炸片或炸条的色泽和品质。块茎“低温糖化”是个复杂的数量性状，涉及淀粉—糖代谢的多种路径，调节和反馈因子多，因此“低温糖化”的机理研究是马铃薯加工品质改良的重要基础工作。本研究拟探索不同温度贮藏条件下马铃薯淀粉—糖代谢的主要酶类与还原糖含量的动态变化关系，明确其主要的调控因子。在此基础上，结合前人的研究结果，分离克隆淀粉—糖代谢关键酶的调控基因，并通过转化马铃薯进行功能验证，以进一步揭示马铃薯块茎淀粉—糖代谢的分子机理，为改良马铃薯加工品质提供理论依据和技术基础。研究取得的主要结果如下： 1.以不同贮藏温度条件下的鄂马铃薯1号(E1)和鄂马铃薯3号(E3)品种为材料，对贮藏块茎还原糖、总糖含量及淀粉-糖代谢中酶活性变化规律进行研究，以明确马铃薯炸片色泽指数的主要影响因素。结果表明，贮藏期间低温是促进块茎还原糖累积的主要影响因素，还原糖含量与炸片色泽具有极显著直线正相关关系。进一步分析表明，在4℃贮藏条件下，腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(AGPase)、尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(UGPase)和蔗糖合成酶活性(SuSy)与块茎还原糖含量呈显著负指数相关，酸性转化酶(AcidInv)和碱性转化酶(AlkalineInv)活性与块茎还原糖的积累呈显著直线正相关，是淀粉—糖代谢过程中影响块茎“低温糖化”的主要因子。 2.转化酶抑制子是一类同源性较低的蛋白质家族，通过转化酶抑制子的调控可能达到抑制转化酶活性，进而调控还原糖积累的效果。本研究根据已报道的烟草转化酶抑制子序列设计特异引物，通过RT-PCR法在烟草T1系中成功分离到液泡转化酶抑制子基因Nt-inhh全长cDNA。序列分析表明，该基因编码区与报道的Nt-inhh基因完全一致。通过构建35S和块茎特异的patatin启动子调控下含有Nt-inhh基因cDNA的表达载体转化马铃薯。分析转基因植株块茎在4℃和20℃贮藏一个月后还原糖含量与液泡酸性转化酶活性表明，Ⅵ活性下降幅度为22.7％(株系A-3)至78.7％(株系B-13)，还原糖下降幅度为20％(株系A-17)至80.5(株系A-30)，说明Nt-inhhcDNA在马铃薯中的表达成功抑制了液泡酸性转化酶的活性，导致还原糖含量降低。实验还进一步证实了低温贮藏块茎液泡酸性转化酶活性与还原糖含量呈正相关关系。 3.转化酶抑制子是高等植物普遍存在的一类蛋白质家族，本研究用RT-PCR结合5，RACE方法从马铃薯栽培种JH块茎中克隆了转化酶抑制子St-inhcDNA。序列分析表明，St-inh基因编码区全长663bp，编码221个氨基酸。将St-inh基因克隆到pET28a(+)上，转化大肠杆菌BL21(DE3)后成功实现了表达。基因表达产物与马铃薯栽培品种(系)E1、JH试管块茎以及番茄果实的转化酶提取物共孵育结果显示，其转化酶活性分别下降了34.3％、21％和33.8％。表达产物与E3叶片Ⅵ和CWI提取物反应显示，随着表达产物量的增加，抑制作用加强，说明St-inh的翻译产物具有转化酶抑制子功能。T-COFFEE氨基酸序列对比分析显示，St-inh与Kunitz-typeC类基因序列同源性达95％以上，该基因编码的蛋白质具有典型的Kunitz-type结构域[L，I，V，M]-X-D-X-[E，D，N，T，Y]-[D，G]-[R，K，H，D，E，N，Q]-X-[L，I，V，M]-X(5)-Y-X-[L，I，V，M]，因此St-inh基因可能为Kunitz-type家族成员。氨基酸序列Clustalw分析表明，St-inh与Ara-inh、Nt-inhh、Nt-inh、To-inh、Pa-inh、Ip-inh、Ci-inh以及Zm-inh的同源性为14.2～21.0％，说明转化酶抑制子是一类同源性较低的蛋白质家族，所克隆的St-inh是一个新的来自马铃薯的转化酶抑制子基因。 4.从鄂马铃薯3号试管块茎DNA中分离了低温诱导的启动子LTP，构建35S和LTP驱动的正义St-inh基因的表达载体分别转化鄂马铃薯3号，PCR、Northern杂交检测表明已经成功获得表达St-inhcDNA的转基因植株。转基因植株块茎4℃和20℃贮藏一个月后，块茎还原糖含量降幅最大的达80.3％(E-1)，Ⅵ下降幅度最大的达54.2％(D-7)。4℃时，与对照比较，所检测转基因植株平均还原糖含量下降21.0％，Ⅵ活性下降19.0％，Ⅵ活性与还原糖含量存在明显的相关关系，进一步说明转化酶是块茎“低温糖化”的主要因素之一，通过调控转化酶抑制子的表达可有效调控转化酶活性和还原糖积累。进一步的Northern杂交分析表明，与非转基因株系比较，由于正义St-inh基因的转入，St-inh表达量明显增加，且低温诱导启动子控制下的St-inh在低温贮藏块茎中的表达显著提高，但所使用的启动子对块茎还原糖积累的抑制作用影响不大，说明组成型或诱导型的St-inh基因表达对贮藏块茎还原糖积累影响不存在显著差异。

目录

缩略词表

摘 要

第一章综述

1.1课题的提出

1.2前人研究进展

1.2.1马铃薯加工品质育种目标和现状

1.2.2马铃薯块茎炸片质量的影响因素

1.2.3马铃薯贮藏块茎“低温糖化”的生理生化机理

1.2.4马铃薯块茎低温贮藏相关基因表达的研究

1.2.5马铃薯抗“低温糖化”的策略

1.2.6转化酶抑制子的研究进展

1.3本研究的目的和意义

第二章材料与方法

2.1 RNA与DNA的提取

2.1.1烟草叶片RNA的提取(用于反转录和Northern分析)

2.1.2马铃薯块茎总RNA的提取(用于反转录和Northern分析)

2.1.3马铃薯叶片DNA小量抽提(用于转基因植株PCR检测)

2.1.4马铃薯植株DNA的抽提与纯化(用于Southern杂交)

2.2转化酶抑制子全长cDNA的克隆

2.2.1 cDNA第一链的合成

2.2.2转化酶抑制子全长cDNA克隆

2.3质粒的抽提及其向农杆菌的转化

2.3.1质粒DNA小量制备

2.3.2质粒DNA大量制备

2.3.3大肠杆菌感受态细胞的制备及转化

2.3.4农杆菌感受态的制备及转化

2.3.5农杆菌介导的基因转化

2.4转基因植株的Northern杂交

2.5转基因植株的Southern杂交

第三章马铃薯贮藏块茎碳水化合物代谢路径及其主要调节因子分析

3.1前言

3.2材料与方法

3.2.1供试材料与预处理

3.2.2块茎炸片的加工及色泽确定

3.2.3块茎还原糖和可溶性总糖分析

3.2.4酶的提取和活性测定

3.3结果与分析

3.3.1贮藏温度对块茎还原糖、总糖含量及炸片色泽的影响

3.3.2淀粉代谢酶活性变化及其对贮藏块茎还原糖含量的影响

3.3.3蔗糖代谢酶活性变化及其对贮藏块茎还原糖含量的影响

3.4讨论

第四章烟草液泡转化酶抑制子的克隆及其在马铃薯中的表达

4.1前言

4.2材料和方法

4.2.1植物材料

4.2.2菌株、酶和试剂

4.2.3烟草液泡转化酶抑制子的克隆和表达载体的构建

4.2.4马铃薯的遗传转化

4.2.5再生植株的分子鉴定

4.2.6马铃薯转基因株系转化酶活性和还原糖含量分析

4.3结果与分析

4.3.1烟草Nt-inhh基因的克隆、表达载体的构建及序列分析

4.3.2外源基因的遗传转化与转基因植株的PCR鉴定

4.3.3转基因植株的Southern杂交分析

4.3.4转基因植株Northern杂交分析

4.3.5转基因马铃薯块茎贮藏后还原糖和酶活性的变化

4.4讨论

第五章马铃薯转化酶抑制子St-inh cDNA克隆及在大肠杆菌中的表达和功能测定

5.1前言

5.2材料和方法

5.2.1材料

5.2.2方法

5.3结果与分析

5.3.1 St-inh cDNA克隆

5.3.2基因序列分析

5.3.3 St-inh在大肠杆菌中的表达

5.3.4 St-INH蛋白对转化酶的抑制作用

5.4讨论

第六章马铃薯转化酶抑制子的功能分析

6.1前言

6.2材料与方法

6.2.1植物材料

6.2.2菌株和质粒

6.2.3低温诱导启动子LTP克隆

6.2.4载体构建

6.2.5转基因株系的获得

6.2.6转基因株系的分子鉴定以及还原糖含量、酶活性检测

6.3结果与分析

6.3.1低温诱导启动子LTP的克隆

6.3.2表达载体的构建

6.3.3转基因马铃薯抗性植株的获得和PCR检测

6.3.4转基因植株的Southern杂交

6.3.5转基因植株Northern杂交分析及试管苗叶片转化酶活性测定

6.3.6贮藏转基因马铃薯块茎还原糖含量和转化酶活性变化

6.4讨论

第七章讨论

7.1马铃薯块茎低温贮藏期间还原糖积累的主要调节酶类

7.2转化酶抑制子与其对转化酶的抑制作用

7.3马铃薯“低温糖化”机理研究与抗性改良

参考文献

附录A：Nt-inhh基因GenBank登记信息

附录B：St-inh基因GenBank登记信息

附录C：低温诱导的启动子LTP GenBank登记信息

附录D：pET-28a(+)载体图谱

附录E：发表和已经准备的论文

致谢