水稻白叶枯病成株抗性机理研究

摘要

成株抗性是一种苗期表现为感病，生长发育到一定时期后表现为抗病的现象。成株抗性在多种植物多种病害中存在。迄今为止，成株抗性的机理不甚清楚。作者研究了水稻白叶枯病成株抗性生理生化特点，并从分子水平对其抗病性机理进行了初步探讨，主要结果如下： 1.运用DDRT-PCR方法，用90对引物组合对水稻白叶枯病成株抗性品种早生爱国3号苗期、成株期病原菌和清水接种材料进行了差异表达基因筛选。总共约筛选了7000个基因片段，其中有9个基因为成株期病原菌诱导特异表达。对3个差异表达片段进行了克隆测序，结果发现这3个片段编码序列相同，即编码NADH脱氢酶。经Northernblot分析，其在苗期和成株期各处理间表达无差异，这一结果表明筛选的基因可能为假阳性，另一种可能就是编码NADH脱氢酶基因表现为转录后调节。 2.运用cDNA-AFLP技术，用256对引物组合对早生爱国3号苗期、成株期接种病原菌和清水材料进行差异表达基因筛选。在筛选的约16000个基因片段中，共检测到成株抗性相关的差异表达cDNA片段122个。对70个cDNA片段进行了克隆测序。经同源序列比较，41个基因为已知功能基因，这些基因包括参与光反应的基因、表达调控基因及防卫基因。29个基因为功能未知基因。对2个基因进行Northernblot分析和22个基因进行RT-PCR分析，其中11个基因差异表达明显。 3.为了探讨水稻白叶枯病成株抗性是否与生长发育及病原菌诱导的基因组甲基化水平有关，采用MSAP(methylatonsensitiveamplifiedpolymorphism)技术对早生爱国3号苗期、成株期接种病原菌、清水接种及未处理材料进行了全基因组甲基化扫描。在所扫描的2000个基因片段中，共检测到甲基化多态性位点380个，其中受苗期生长发育诱导的多态性位点为8.7％，苗期病原菌诱导的为1.6％，成株期生长发育诱导的为0.5％，成株期病原菌诱导的为0.8％。表明不同生育时期的甲基化水平可能与成株抗性相关。 4.为了探讨是否生长发育及病原菌诱导的转座子的激活与水稻白叶枯病成株抗性相关，运用SSAP(sequencespecificamplifiedpolymorphism)技术检测了早生爱国3号苗期、成株期接种病原菌、清水接种及未处理材料基因组LTR逆转座子Tos17的拷贝数差异。在所检测的2000个基因片段中，苗期生长发育诱导激活的Tos17为0.45％，苗期病原菌诱导激活的Tos17为0.15％，成株期生长发育诱导激活的Tos17为0.1％，成株期病原菌诱导激活的Tos17为0.15％。表明生长发育诱导激活的逆转座子可能与水稻白叶枯病成株抗性相关。 5.植物抗病反应最终通过防卫基因的表达而起作用。通过RT-PCR方法检测了防卫基因PAL、LOX、PBZ1、PR1a及Cht1在早生爱国3号苗期、成株期接种病原菌和清水接种后不同时段的表达。结果表明，苗期PAL受病原菌诱导上调表达，而成株期病原菌和伤害均可诱导PAL上调表达，成株期诱导表达强于苗期。苗期和成株期病原菌都可诱导LOX表达，但成株期表达强于苗期且更持久。PBZ1在苗期和成株期均受病原菌和伤害诱导表达，成株期表达较苗期早且更强。没有检测到PR1a和Cht1的表达。 6.植物中活性氧物质及一些参与氧代谢反应的酶在植物的抗病反应中发挥着巨大作用。为了研究这些物质是否在水稻白叶枯病成株抗性中发挥作用，分析了水稻白叶枯病成株抗性与过氧化氢(H2O2)含量、过氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)活性变化的关系。结果表明：接种白叶枯病菌T7133后，苗期与成株期植株体内H2O2含量上升以及POD、PPO、SOD活性增加。与苗期叶片相比，成株期叶片H2O2含量高，且PPO和SOD的酶活性增强，而POD的酶活性则降低。苗期和成株期CAT的酶活性均低于对照，成株期比苗期CAT活性更低。这些结果表明H2O2、PPO、SOD和CAT可能与水稻白叶枯病成株抗性之间存在一定的关联，而POD则没有直接关系。

目录

文摘

英文文摘

第一章前言

1.1文献综述

1.1.1植物防卫反应类型

1.1.2植物抗病的分子机制

1.1.3植物成株抗性研究

1.1.4水稻白叶枯病成株抗性研究

1.2研究目的和意义

第二章水稻白叶枯病成株抗性相关基因的表达研究

2.1材料和方法

2.1.1供试白叶枯病菌株及水稻品种

2.1.2菌株培养

2.1.3供试水稻品种种植、接种鉴定及取样

2.1.4抗性鉴定

2.1.5 RNA提取

2.1.6 DDRT-PCR和cDNA-AFLP分离成株抗性相关基因

2.1.7差异表达片段的验证

2.2结果分析

2.2.1苗期、成株期植株抗病表现

2.2.2 DDRT-PCR分离成株抗性相关基因

2.2.3 cDNA-AFLP分离成株抗性相关基因

2.3讨论

2.3.1 DDRT-PCR和cDNA-AFLP技术的灵敏性

2.3.2 DDRT-PCR和cDNA-AFLP技术的假阳性

2.3.3光反应与水稻白叶枯病成株抗性

2.3.4外因遗传调节与水稻白叶枯病成株抗性

2.3.5防卫基因

第三章水稻白叶枯病成株抗性的甲基化研究

3.1材料与方法

3.1.1供试白叶枯病菌株及水稻品种

3.1.2取样及DNA提取

3.1.2 Methylation-sensitive amplification polymorphism(MSAP)

3.2结果与分析

3.2.1 MSAP检测到的甲基化模式

3.2.2早生爱国3号苗期、成株期及不同处理间的甲基化差异

3.3讨论

第四章逆转座子Tos17激活与水稻白叶枯病成株抗性

4.1材料与方法

4.1.1供试白叶枯病菌株及水稻品种

4.1.2取样及DNA提取

4.1.3 Sequence-Specific Amplification Polymorphism(SSAP)

4.2结果与分析

4.2.2早生爱国3号苗期、成株期及不同处理间的SSAP多态性

4.3讨论

4.3.1 SSAP检测基因组激活的LTR逆转座子的效率

4.3.2 LTR逆转座子与水稻白叶枯病成株抗性

第五章防卫基因在水稻白叶枯病成株抗性中的表达

5.1材料与方法

5.1.1供试白叶枯病菌株及水稻品种

5.1.2 RNA提取和RT-PCR

5.1.3 PAL和LOX酶活性分析

5.2结果与分析

5.2.1抗性鉴定

5.2.2 RT-PCR分析PAL，LOX，PBZ1，Cht-1和PR-1a的表达

5.2.3 PAL和LOX酶活性分析

5.3讨论

第六章H2O2含量及有关抗性相关酶活性的测定

6.1材料与方法

6.1.1供试白叶枯病菌株及水稻品种

6.1.2 H2O2含量测定

6.1.3 POD、PPO、CAT和SOD制备与活性测定

6.1.4蛋白质含量的测定

6.2结果与分析

6.2.1苗期、成株期叶片H2O2含量变化

6.2.2苗期、成株期叶片POD活性变化

6.2.3苗期、成株期叶片PPO活性变化

6.2.4苗期、成株期叶片SOD活性变化

6.2.5苗期、成株期叶片CAT活性变化

6.3讨论

结语与展望

参考文献

致谢

附录

Appendict Ⅰ Protocol for DDRT-PCR

Appendict Ⅱ Protocol for cDNA-AFLP

Appendict Ⅲ Northern Blot protocol(DIG Probe)

AppendictⅣDNA Extraction Protocol

Appendict Ⅴ感受态细胞制备及热击法质粒转化

AppendictⅥ测序质粒的提取方法