内皮素-1及其受体、受体拮抗剂在肺动脉高压综合征肉鸡中的作用研究

摘要

肉鸡肺动脉高压综合征(pulmonaryhypertensionsyndrome，PHS)亦称肉鸡腹水综合征(ascitessyndrome，AS)，又称“心衰综合征”(heartfailuresyndrome，HFS)等，是快速生长肉鸡的一种常见非传染性疾病，以明显的腹水和心、肺功能衰竭为特征。全世界养鸡业每年因此病而损失巨大，随着养鸡业的发展，该病的发生有逐渐上升之势。肺动脉压升高是肉鸡肺动脉高压综合征的重要特点并对它的形成起决定性作用。内皮素(endothelin-1，ET-1)是一种由内皮细胞合成和分泌的、具有强烈收缩血管作用和促进细胞增生的血管活性多肽，心钠素(atrialnatriureticpeptide，ANP)、血管紧张素H(angiotensinⅡ，AH)、NO等在心血管系统功能的调节中也起着重要作用。为研究肉鸡PHS的发病机理，本试验主要从ET-1角度出发，从以下几个方面对本试验进行了研究：用高能日粮饲喂较多肉鸡的方法获得PHS肉鸡模型；用放射免疫分析方法比较了不同腹水程度肉鸡在不同日龄时血浆和主要组织中ET-1的含量，同时还用硝酸还原酶法和放射免疫法对NO、NOS、ANP、AⅡ在肉鸡PHS发病过程中的作用加以研究；通过免疫组织化学染色方法和RT-PCR的方法研究了ETA受体及其基因在不同腹水程度和不同日龄肉鸡体内的分布情况及其表达水平；通过短期静脉注射ET-1、内皮素受体拮抗剂BQ123和长期给予ET-1的方法研究了ET-1、BQ123对肉鸡肺动脉压、PHS发病率、主要组织病理变化以及一些生理生化指标的影响；同时利用细胞培养的方法研究了ET-1、BQ123、L-Arg、L-NAME对培养的肉鸡心肌细胞的作用，从而比较全面地从ET-1的角度研究了肉鸡PHS的发病机理。主要试验结果如下： (1)用高能日粮饲养肉鸡时从10日龄起有PHS发生，发病率为5.3％-6.7％，与自然情况下的发病率基本相同；右心导管法研究发现2-6周龄时肺动脉高压(PH)组肉鸡的平均肺动脉压(mPAP)极显著(p＜0.01)高于正常组肉鸡；腹水心脏指数(ascitesheartindex，AHI)也极显著(p＜0.01)或显著(p＜0.05)高于正常组，且随日龄的增长有上升的趋势；PH组肉鸡血浆和主要组织(心、肝、肺、肾)中ET-1在2-5周龄时也显著(p＜0.01)或极显著(p＜0.05)高于正常组，而在6周龄时则呈现出复杂的变化；血浆ANP、NO、AⅡ在2-5周龄时显著或极显著高于正常组，随日龄的增长有升高的趋势，而在6周龄时则呈现出不规则的变化；几种组织相比，肺脏ET-1的含量最高；mPAP与血浆ET-1相关性显著，与血浆NO没有相关性，血浆ET-1与NO也没有明显的相关性。 (2)用免疫组织化学染色的方法和RT-PCR的方法对不同腹水程度、不同日龄肉鸡ETAR及其基因在体内定位及其表达变化的情况进行了探讨。免疫组织化学染色的研究结果表明，ETAR在肉鸡主要组织如心脏中的心肌细胞膜、心包膜和血管平滑肌，肝脏中的肝细胞膜和枯否氏细胞，肺脏中的大小血管、次级支气管、三级支气管和肺泡，肾脏的近远曲小管、肾小球、致密斑、髓袢、肾血管均有不同程度的表达；与正常组相比较，PH组、轻度腹水组、重度腹水组肉鸡肺脏各级血管以及肺泡ETAR的表达均比正常组显著或极显著升高，但随着腹水程度的加深，ETAR的表达量反而降低，其中PH组ETAR的表达量最高；随腹水程度的加深，心脏ETAR的表达量显著或极显著降低，但仍显著或极显著高于正常组，右心室心肌中ETAR的表达量明显高于左心室心肌；PH组和轻度腹水组肉鸡肝细胞ETAR的表达量比正常组和重度腹水组均高，而肝血管中腹水组同正常组相比较其表达量极显著降低；肾小管、肾血管、肾小球和致密斑中ETAR的表达随腹水程度的加深也呈现出复杂的变化；对于不同日龄的正常肉鸡，内皮素A型受体基因mRNA在心脏组织中的表达量在16日龄时明显低于30日龄时的表达量，而对于同一日龄(30d)的肉鸡，发生重度腹水的肉鸡内皮素A型受体基因mRNA的表达量明显要低于正常肉鸡。 (3)2-6周龄不同腹水程度(正常组、轻度腹水组、重度腹水组)肉鸡之间相比较，mPAP、AHI以及血浆ET-1、ANP、NO均随腹水程度的加深而显著(p＜0.05)或极显著(p＜0.01)升高，且随日龄的增长而呈升高趋势，而全心/体重比(TV/Bw)随日龄的增长却呈下降趋势；不同腹水程度肉鸡血浆iNOS和cNOS随腹水程度的加深而呈现出复杂的变化；用放射免疫分析的方法对5周龄不同腹水程度的肉鸡主要组织中ET-1、ANP的研究发现，5周龄时主要组织中的ET-1、ANP均随腹水程度的加深其含量显著(p＜0.05)或极显著(p＜0.01)增加，且肺脏和心脏的含量明显高于其它组织中的含量；肺组织中iNOS、cNOS的含量呈现出比较复杂变化趋势，iNOS随腹水程度的加深和日龄的增长而呈升高趋势，而cNOS则随腹水程度的加深呈降低趋势；不同腹水程度肉鸡之间AHI与mPAP以及血浆ANP、ET-1与AHI、mPAP之间存在正相关性，5周龄时mPAP、AHI与心脏ET-1含量之间也存着正相关性，而血清NO含量与血浆ET-1、ANP、心脏ET-1含量之间无明显的相关性。 (4)对28日龄肉鸡分组并从翼静脉注射不同剂量的ET-1、BQ123以及ET-1和BQ123联合应用，并以注射生理盐水组为对照组，对mPAP进行检测，同时还检测了不同时间血浆AⅡ、ANP、ET-1的变化。研究发现，当静脉注射24、120、240ng/kg的ET-1后，高剂量的ET-1可引起血压双向性升高，即先瞬时下降然后呈剂量依赖性升高，内皮素的有效升压剂量为240ng/kg；静脉注射0.5、1、3μg/kg的BQ123能使mPAP呈剂量依赖性下降，且能完全拮抗1×10-8mol/L的ET-1引起的血压升高效应，但不能拮抗ET-1引起的初始血压下降现象；另外在注射ET-1或BQ123后对不同时间血浆ET-1、ANP、AⅡ也有明显的影响。从15日龄开始将170只肉鸡分为3组，对照组50只注射生理盐水，另两组各60只分别注射240、360ng/kg的ET-1，发现ET-1呈剂量依赖性地提高了肉鸡PHS的发病率，并且使试验组肉鸡的红细胞压积(PCV)、mPAP、AHI、血浆NO不同程度地升高，且随日龄的增长而呈现出增加趋势；组织切片显示当长期注射外源性的ET-1后肉鸡主要组织如心、肝、肺、肾均发生了不同程度的病理学变化。 (5)用酶消化法对肉鸡心肌细胞进行培养，并用免疫化学染色方法对肉鸡心肌细胞进行了鉴定，试验采用第3至5代的心肌细胞进行试验。用MTT法以及3H-TdR、3H-Pro、3H-Leu渗入法研究发现，当ET-1的浓度≥1×10-8mol/L时，ET-1对心肌细胞有明显的促生长和促肥大作用，ET-1浓度越高，则其促心肌细胞生长作用越强，1×10-8mol/L的BQ123则可完全拮抗ET-1对心肌细胞的作用，且BQ123浓度越高，则抑制作用越明显，而单独加入不同浓度的BQ123也发现BQ123呈剂量依赖性抑制心肌细胞的增殖；用荧光标记法研究发现，ET-1可呈剂量依赖性地促进心肌细胞内[Ca2+]i内流，BQ123则可拮抗ET-1这种作用，但不能拮抗ET-1初期对心肌细胞[Ca2+]i瞬时增加作用，而单独应用BQ123则对[Ca2+]i没有影响。另外研究还发现L-Arg、L-NAME对心肌细胞的增长有一定的抑制作用。

目录

论文说明：资助、英文缩写词表

摘要

第一部分文献综述

1肉鸡肺动脉高压综合征概述

1.1发病特点

1.2临床症状

1.3病理学变化

1.4血液生理生化

1.5病因

1.6发病机理

1.7疾病诱发和复制

1.8心电图分析

1.9激素、受体方面

1.10从自由基角度方面的研究

1.11疾病防制

1.12临床预测

2内皮素及其受体、受体拮抗剂的研究进展

2.1内皮素的化学结构及分类

2.2内皮素-1的分布和代谢

2.3内皮素的调控、生物合成与释放

2.4内皮素-1的生理与病理作用

2.5内皮素转化酶及其抑制剂

2.6 ET受体的分类、分布及其作用

2.7影响和调节内皮素受体的因素

2.8内皮素受体拮抗剂

2.9内皮素受体拮抗剂的治疗作用

2.10 BQ123的主要生理作用

2.11小结

3 内皮素-1与肉鸡PHS可能存在的关系

3.1内皮素-1与肉鸡肺动脉高压形成之间可能存在的关系

3.2内皮素-1与肉鸡右心肥大和右心衰竭可能存在的关系

3.3小结

4其它心血管活性物质在在心血管系统中的作用

4.1 NO、NOS在心血管系统中的作用

4.2血管紧张素Ⅱ在心血管系统中的作用

4.3 ANP在心血管系统中的作用

第二部分研究的目的和意义

第三部分实验部分

第1章肺动脉高压综合征肉鸡模型的建立以及ET-1在肉鸡体内的分布研究

1.1前言

1.2材料与方法

1.3结果

1.4讨论

第2章内皮素A受体在肺动脉高压综合征肉鸡体内的分布及变化研究

2.1前言

2.2材料和方法

2.3结果

2.4讨论

第3章ET-1、ANP、NO、NOS在肉鸡PHS发生发展过程中的作用

3.1前言

3.2材料与方法

3.3结果与分析

3.4讨论

3.5小结

第4章外源性内皮素-1及其受体拮抗剂BQ123对肉鸡PHS的影响

4.1前言

4.2材料和方法

4.3结果

4.4讨论

第5章ET-1及其受体拮抗剂BQ123对培养的肉鸡心肌细胞的影响

5.1前言

5.2材料与方法

5.3结果

5.4讨论

第四部分实验总结及下步计划

参考文献

致谢

在读期间发表论文题录