苏云金杆菌晶体蛋白对猪蛔虫的作用及猪蛔虫重组As37蛋白的免疫保护研究

摘要

猪蛔虫病是仔猪常见的多发性寄生虫病，可导致仔猪的腹泻、消瘦、贫血，严重的导致仔猪死亡，严重危害养猪业。目前猪蛔虫病的防治以咪唑类药物驱虫为主，这些药物在治疗猪蛔虫的同时对动物机体均有不同程度的副作用，且不同程度的残留，危害人类健康、污染环境，所以需要寻找防治猪蛔虫病的一种新药。自1972年发现苏云金芽胞杆菌(Bt)对植物寄生线虫具有杀虫活性以来，随后发现Bt伴胞晶体毒素对蛇形毛圆线虫、捻转血矛线虫、日本血吸虫等动物寄生虫的毒性。本研究旨在寻找高毒力的Bt菌株对猪蛔虫进行有效治疗。另外，关于猪蛔虫的免疫研究近年来取得了一定的进展，国外先后报道了猪蛔虫重组抗原的免疫活性；国内在猪蛔虫的免疫上还是空白，尚未见到商用猪蛔虫疫苗。为了更好地防治猪蛔虫，本研究克隆了猪蛔虫rAs37基因，构建原核表达载体进行高效表达，并对表达蛋白的免疫活性进行了分析，为开发猪蛔虫亚单位疫苗打下基础。主要研究工作和结果如下： 1．Bt伴胞晶体毒素对体外培养的猪蛔虫幼虫的毒力 将感染性猪蛔虫卵对小白鼠进行人工感染，获得三期、四期蛔虫幼虫，经体外培养，用Bt YBT-1517，YBT-1518，YBT-1521，YBT-1532，YBT-1537，R<,1>，R2伴胞晶体毒素分别作用于幼虫，结果发现七种毒素均对猪蛔虫三期幼虫有毒杀作用。随着作用时间的延长，毒素浓度的增加，虫体运动缓慢，死亡率增加，其在24h、48h时的半数致死剂量分别为0.875mg／mL，0.434mg／mL；0.934 mg／mL，0.452mg／mL：1.375 mg／mL，0.843mg／mL；1.023 mg／mL，0.623 mg／mL；1.112 mg／mL，0.674 mg／mL：0.951mg／mL，0.458 mg／mL：0.958mg／mL，0.460 mg／mL。YBT-1517对猪蛔虫三期幼虫杀虫效果最好，YBT-1518与其毒力相当，而YBT-1521的半数致死量较其他菌株大。毒素含量越高，幼虫死亡率越高，毒素作用时间的延长，其半数致死剂量降低。 YBT-1517，YBT-1518，R<,1>，R2四种菌株的晶体蛋白对四期幼虫有毒杀作用。其在24h、48h时的半数致死剂量分别为0.935mg／mL，0.452mg／mL；0.875mg／mL，0.415mg／mL：0.904mg／mL，0.453mg／mL；0.886mg／mL，0.448mg／mL。YBT-1518、YBT-1517、R<,1>、R2四种晶体蛋白毒力相当，其中YBT-1518晶体毒素对猪蛔虫四期幼虫的杀虫效果略高于其它三种毒素。 2．Bt伴胞晶体毒素对小鼠体内猪蛔虫幼虫不同作用方式的研究及其免疫定位 感染猪蛔虫的小鼠经静脉注射、肌肉注射、灌胃、腹腔注射YBT-1517，YBT-1518晶体毒素，结果发现毒素均对小鼠体内蛔虫幼虫有显著驱杀效果，静脉注射减虫率最高，效果极显著，高于其它三种方式，而肌肉注射则次之，灌胃与腹腔注射无差异。YBT-1517减虫率分别为72.7％、19.1％、14.6％、14.36％；YBT-1518减虫率为70.87％、32.83％、19.10％、20.51％。YBT-1517与YBT-1518晶体蛋白毒力相当。 通过对YBT-1517晶体蛋白的免疫组织化学定位研究，表明晶体蛋白主要作用于蛔虫的表皮及肠道，这与国外学者报道的晶体蛋白作用动物寄生线虫部位一致。 3．Bt伴胞晶体毒素对猪体内蛔虫的作用及其血液生理生化指标的分析 对感染猪蛔虫的仔猪通过肌肉注射不同剂量YBT-1517晶体蛋白，进行连续治疗，粪便检查的结果显示，晶体蛋白高剂量组(16.08mg)的EPG(每克粪便虫卵数)为O，而晶体蛋白低剂量组(9.45mg)的EPG为394个，未经晶体蛋白作用对照组的EPG为2113个，两者差异极显著，证明晶体蛋白对猪体内蛔虫具有较好的杀灭作用。对猪血液生理生化指标GPT、GOT、LDH、ALP、RBC、HB、HCT 等进行监测，表明苏云金芽胞杆菌伴胞晶体毒素对猪无毒副作用。 4．猪蛔虫rAs37基因的克隆、表达 从感染性猪蛔虫卵中提取总RNA，设计特异性引物，采用RT-PCR．方法扩增得到猪蛔虫As37基因的CDS序列，cDNA片断为966bp。测序结果经BLAST分析，与报道的As37的序列同源性为100％。并将其克隆至大肠杆菌表达载体pGEX-KG，构建了表达rAs37的表达载体pGEX-KG-As37；将重组质粒转化至大肠杆菌BL2l进行表达，得到约62kD目的蛋白GST-As37，Westem blot分析表明，融合蛋白中的As37蛋白具有良好的生物活性。 5．猪蛔虫重组表达As37蛋白的免疫保护研究 将40只6周龄BALB/C小鼠随机分成4组，分别用重组GST-As37蛋白、GST蛋白免疫鼠，同时设空佐剂FCA组及完全空白对照组。各组小鼠均免疫3次，每次间隔14d。小鼠在免疫的35d经口接种2,500个感染性猪蛔虫卵，7d后取肝、肺查虫。结果表明，重组的As37蛋白能有效保护宿主抵抗猪蛔虫的攻击，虫体比对照组减少79.2％，与其它三组差异显著。对免疫前后鼠血清的ELISA检测表明，免疫后14d可检测出血清中IgG-As37抗体，随着免疫次数及免疫剂量的增加，血清中抗体滴度也随之提高，在42d时，As37组血清IgG的OD<,630>值达到0.853。血清中IgG水平差异表现为As37组>GST组>FCA>对照组，As37组与其它组差异显著。

目录

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摘要

缩略词表

第1章文献综述

第2章苏云金芽胞杆菌伴胞晶体毒素对体外培养的猪蛔虫幼虫的毒力

第3章苏云金芽胞杆菌伴胞晶体蛋白对小鼠体内猪蛔虫幼虫不同作用方式驱虫效果的研究及其免疫定位

第4章Bt伴胞晶体蛋白对猪体内蛔虫的作用及其血液生理生化指标的分析

第五章猪蛔虫rAs37基因的克隆及原核表达

第六章猪蛔虫重组表达蛋白的免疫保护研究

总结

参考文献

致谢