新城疫病毒F基因和HN基因的克隆、表达及其ELISA抗体检测方法的初步建立

摘要

新城疫（Newcastle Disease，ND）又名亚洲鸡瘟，是由新城疫病毒（NDV）引起的一种多病型的高度接触性传染病，主要侵害鸡、火鸡、其它家禽和野禽类，也可感染人，是一种世界范围内的重要的A类传染病，也是我国养鸡业中几十年来长期坚持的免疫预防的主要传染病之一。由于新城疫的流行，给全球养禽业造成了巨大的经济损失。本研究用RT-PCR方法，从新城疫病毒La Sota株基因组中克隆、鉴定了融合蛋白基因（F基因）和血凝素一神经氨酸酶基因（HN基因），并在大肠杆菌中进行了高效表达，得到了具有免疫活性的表达产物。以纯化的HN表达产物为抗原，建立了新城疫病毒抗体ELISA快速检测技术，为鸡新城疫基因工程疫苗及快速诊断试剂的研制奠定了扎实的基础。本实验的主要研究内容包括： 1．新城疫病毒融合蛋白（F）基因和血凝素神经氨酸酶（I-IN）基因的克隆与序列分析通过设计四对带有BamHI和HindⅢ酶切位点的引物，利用RT-PCR扩增以及亚克隆的方法，从新城疫病毒La Sota系中扩增出F基因和HN基因，将两种扩增产物分别克隆进pMDl8-T载体，经限制性酶切及序列测定，结果F基因、HN基因分别为1677 bp和1734 bp，与GenBank中登录的相应F基因和HN基因大小一致，同源性在99％以上。 2．新城疫病毒融合蛋白（F）基因和血凝素一神经氨酸酶（HN）基因的亚克隆及原核表达用PCR方法，获得了缺失F蛋白信号肽、胞质区和跨膜区的F基因以及缺失了HN蛋白胞质区、跨膜区的HN基因，再将其亚克隆到pGEX-KG中，与GST蛋白融合表达，经IPTG诱导、SDS-PAGE分析，融合表达的蛋白分子量分别约为78 KDa和84 KDa。Western blot印迹表明两种表达蛋白均具有较强的免疫学活性。 3．新城疫病毒抗体HN-ELISA快速检测方法的初步建立用纯化的HN表达蛋白为包被抗原，初步建立了检测鸡新城疫病毒血清抗体的HN-ELISA快速检测方法。经测定，抗原的最佳包被浓度为0．9μg／孔，被检血清最佳稀释度为1：80。与禽流感H5、H7、H9亚型阳性血清、鸡传染性支气管炎、鸡传染性法氏囊等5种标准阳性血清无任何交叉反应，灵敏度比HI高约40倍。用HN-ELISA方法检测了湖北武汉、安陆、新州等地657份被检鸡血清，总阳性率达78.99％，表明该方法具有特异性强、敏感性高、重复性好的特点，可用于鸡新城疫抗体水平的快速监测。

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摘要

第1章文献综述

第2章新城疫病毒F、HN基因的克隆表达及其蛋白的纯化

第3章新城疫病毒抗体HN-ELISA检测方法的初步建立

参考文献

致谢