甘蓝型油菜cDNA差减文库和均一化文库的构建

摘要

油菜是我国主要的油料作物，大约有50％的食用植物油来源于油菜。长期以来，选育高产优质油菜一直是育种家所面临的主要任务。实践证明，杂种优势的利用是提高油菜产量的主要途径，而雄性不育是杂种优势利用的重要手段。隐性细胞核雄性不育因其具有不育性彻底、稳定、恢复源广等优点，在国内已经成为杂种优势利用的一个重要途径，但由于得不到100％的不育系，在杂交制种时需人工拔除不育系株行中50％的可育株，限制了其广泛应用。 本研究以甘蓝型油菜双隐性细胞核雄性不育系S45AB为材料，利用抑制性差减杂交技术（SSH）构建了S45AB小花蕾期的正反向差减文库。对差减文库进行质量检测表明其质量完好。藉此，可以通过反向Northern杂交技术筛选到育性相关基因，分析S45AB雄性不育机理，为更好地利用S45AB打下坚实的基础。 另外，我们利用双链特异性核酸酶（duplex-specific nuclease，DSN）均一化方法构建了甘蓝型油菜华杂4号小花蕾的均一化文库。对均一化文库进行评价结果表明其均一化效果理想。利用这个文库，可以制备油菜基因芯片，来进行油菜功能基因组研究。

目录

文摘

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论文说明：缩略语表

声明

第一章前 言

1油菜杂种优势与利用

1.1油菜杂种优势利用的途径

1.2油菜细胞核雄性不育的研究

2植物差异表达基因克隆技术及研究进展

2.1 mRNA差异显示技术(DDRT-PCR)

2.2 cDNA代表性差异分析(RDA)

2.3抑制性差减杂交

2.4 cDNA-AFLP

2.5基因表达系列分析(SAGE)

2.6 cDNA芯片技术(cDNA microarray)

2.7本研究所用抑制性消减杂交方法原理与技术介绍

3均一化文库构建技术的发展及其应用

3.1复性式均一化技术

3.2与基因组饱和杂交法

4本研究的目的与意义

第二章材料与方法

2.1实验材料

2.2实验方法

2.2.1取材

2.2.2提耿总RNA和纯化mRNA的方法

2.3 SSH差减文库的构建

2.3.1 cDNA第一链的台成

2.3.2 cDNA第二链的台成

2.3.3用RsaI酶消化cDNA

2.3.4接头连接

2.3.5第一次杂交

2.3.6第二次杂交

2.3.7第一次PCR扩增

2.3.8第二次PCR扩增

2.3.9差减效率的PCR检测

2.3.10差减片段与载体的连接

2.3.11连接产物转化(以下操作均在无菌环境下进行)

2.3.12差减文库插入片断长度检测

2.4均一化文库的构建

2.4.1合成双链cDNA

2.4.2准备DSN Solution

2.4.3杂交(hybridization)

2.4.4 cDNA的均一化

2.4.5均一化cDNA的第一次扩增

2.4.6均一化cDNA的第二次扩增

2.4.7均一化cDNA(第二次扩增后)与载体连接

2.4.8连接产物转化

2.4.9均一化文库插入片断长度检测

2.4.10 eDNA均一化效果分析

第三章结果与分析

3.1总RNA含量和质量的检测

3.2 mRNA的质量检测

3.3 SSH文库的构建及质量检测

3.3.1 cDNA合成与酶切

3.3.2差减效率检测

3.3.3差减产物克隆

3.4均一化文库的构建及质量检测

3.4.1 cDNA的合成

3.4.2均一化cDNA的第一次扩增

3.4.3均一化cDNA的第二次扩增

3.4.4克隆数目和重组率的鉴定

3.4.5插入片断长度的检测

3.4.6均一化cDNA文库的均一化效果分析

第四章讨论

4.1 RNA的提取和mRNA的纯化

4.2抑制性差减杂交分离差异表达基因的有效性

4.3均一化方法的评价

4.3.1两种主要均一化方法特点分析

4.3.2 DSN法与其它均一化方法的比较

参考文献

致 谢