猪四个转录因子基因克隆、表达、定位及其与部分性状的关联分析

摘要

转录因子是真核表达调控中非常重要的一类反式作用因子,在细胞的增殖、分化与动物的生长发育中起着关键的作用。随着动物基因组计划的进行,许多影响猪经济性状的重要基因逐渐被发现,取得了广阔的应用前景。近些年来,国内外已经研究鉴定了许多与猪生长发育有关的重要转录因子,为猪的育种奠定了基础。但仍有许多重要的转录因子在猪上还未研究。
　　 本研究利用生物信息学与分子生物学技术相结合的方法,克隆和定位了四个转录因子基因,取得了如下成果:
　　 1.利用生物信息学结合RT-PCR克隆获得了猪TEF-1、RTEF-1、KLF6和KLF7四个转录因子基因完整编码区的cDNA序列。
　　 2.利用RH克隆板对TEF-1、RTEF-1、KLF6和KLF7四个基因分别进行了染色体精细定位,结果表明TEF-1基因定位于SSC2p14-2p17,与SW1857连锁(LOD值为9.77)；RTEF-1基因定位于SSC5q24-5q25,与SW1987连锁(LOD值为6.29)；KLF6基因定位在SSC10q14-q16,与SW104J连锁(LOD值为6.39)；KLF7则定位在SSC15q24,与SWR1002连锁(LOD值为11.3)。
　　 3.采用半定量RT-PCR技术检测基因的表达水平,结果表明猪TEF-1基因在所检测的90天胚胎组织中广泛表达,其中在肝和肺中表达量较高,在成年组织中也是广泛表达,肌肉中表达量最高,不同时期肌肉组织中表达量呈上升趋势。RTEF-1基因在检测的90天胚胎组织中广泛表达,其中肝、肺和肌肉中表达量较高,而且在肌肉组织中存在两种转录本；两种转录本在成年肌肉组织中特异表达,且表达量均较高。对KLF6和KLF7基因组织表达谱检测,结果表明KLF6和KLF7都是广泛表达的转录因子基因。
　　 4.采用PCR-RFLP方法检测了TEF-1基因5’非翻译区(UTR)中距离起始密码子154bp的一个碱基突变位点,并在本室与通城县畜牧局共同组建的试验群体中检测了TEF-1基因5’非翻译区的突变位点的多态性,结果表明,该基因5’非翻译区的突变位点与猪出生至上市日增重显著相关(P<0.05)。发现了已克隆KLF6基因cDNA序列的两个错译突变C459G和C778T,分别导致脯氨酸/精氨酸和丙氨酸/缬氨酸的改变,在本室与通城县畜牧局共同组建的试验群体中检测并没有发现其与生长、肉质等性状有显著的关系。
　　 5.构建猪RTEF-1基因重组原核表达载体pET28a-RTEF-1,利用SDS-PAGE检测出该重组原核表达载体成功表达出了猪RTEF-1蛋白,并用亲和层析技术纯化出了该蛋白。

目录

文摘

英文文摘

基金项目

缩略词表(ABBREVIATIONS)

主要性状的中英文对照和缩写

1 文献综述

1.1 前言

1.2 猪生长性状相关转录因子研究进展

1.3 猪转录因子新基因的分离方法

1.3.1 生物信息学在分离克隆基因中的应用

1.3.2 基因文库技术分离目的基因

1.3.3 基因芯片技术分离目的基因

1.4 SNP的发现与检测

1.5 四个拟分离基因的研究进展

1.5.1 TEAD基因家族两个基因TEF-1和RTEF-1的研究进展

1.5.2 KLF家族两个基因KLF和KLF的研究进展

2 研究的目的和意义

3 材料与方法

3.1 材料

3.1.1 组织样品

3.1.2 DNA样品

3.1.3 载体和菌株

3.1.4 主要试剂

3.1.5 试剂的配制

3.1.6 主要仪器设备

3.1.7 主要分子生物学软件和网站

3.2 方法

3.2.1 候选基因的分离

3.2.2 基因染色体定位的SCHP和RH法

3.2.3 基因组织表达谱与时空表达谱研究

3.2.4 基因的多态性检测方法

3.2.5 基因多态性与性状的关联分析方法

3.2.6 猪RTEF-1基因的原核表达及蛋白纯化

4 结果

4.1 基因的克隆结果

4.1.1 猪TEF-1基因分离及其序列分析

4.1.2 猪RTEF-1基因分离及其序列分析

4.1.3 猪KLF6基因分离及其序列分析

4.1.4 猪KLF7基因分离及其序列分析

4.2 基因的染色体定位结果

4.2.1 染色体区域定位结果

4.2.2 精细定位结果

4.3 基因的时空表达结果

4.3.1 TEF-1和RTEF-1基因的时空表达结果

4.3.2 KLF6和KLF7基因的组织表达结果

4.4 猪TEF-1基因遗传多态检测分析结果

4.5 猪TEF-1的遗传变异与部分经济性状的关联分析结果

4.6 KLF6基因的多态检测分析

4.7 RTEF-1基因的原核表达及纯化:

4.7.1 RT-PCR扩增结果

4.7.2 猪RTEF-1基因的原核表达载体的构建

4.7.3 原核表达载体pET28a-RTEF-1的鉴定

4.7.4 IPTG诱导重组原核表达载体表达RTEF-1蛋白

4.7.5 RTEF-1重组蛋白的纯化结果

5 讨论

5.1 基于表达序列标签(EST)的基因的功能研究

5.1.1 利用EST信息分离基因

5.1.2 利用EST信息分析基因变异

5.2 关于基因的定位

5.3 关于基因的时空表达谱

5.4 关于TEF-1基因的多态检测及性状关联分析

5.5 关于基因的原核表达及蛋白纯化

5.6 关于选择性剪接

6 小结

6.1 本研究获得的结果

6.2 本研究的创新点

6.3 本研究不足之处及下一步值得研究的工作

参考文献

致谢