苏云金芽胞杆菌YBT1520 WGS法拼接和蜡状芽胞杆菌群进化分类及16S rDNA分子指标分析

摘要

本研究分为两部分，第一部分是用WGS法进行Bt YBT1520的全基因组测序工作。具体流程是包括：第一，构建好的文库进行末端测序，用phred程序将色谱图文件转变为phd格式的数值信号文件，phd2fasta将phd文件转变为fasta文件。第二，用phrap程序将末端测序read的fasta文件拼接成一系列的contig。第三，通过contig间的关系设计测序引物，填补空洞(gap-filling)。在观测大规模测序的read，发现许多特异的contig1)高拷贝小质粒和染色体组测序的覆盖度相差竟达到10倍。；2)该基因组上rDNA，Cry，IS，Tn等在基因组的不同位置有多个拷贝，同源序列长度大于read测序的最大值范围500-700bp。这就使得计算机无法将相关的read组装成与基因组排列相同的contig，造成了严重的错拼。填补空洞的过程分四个层次：1)洞数从2000-1400，主要的策略是增加测序量；2)1400-400，主要的策略是根据PUC read的正反向关系寻找contig的关系补洞；3)400-100，主要是依据BAC的和参考系列来测序寻找contig的关系补洞；4)100-8，主要是依据参考序列，fosmid文库，参考序列和端头随机扩增和测序的方法。模板的不同选择也影响着其效率。模板为高拷贝PuC18和PCR产物最好，pBeloBAC11次之，总基因组因为背景复杂所以效果不是很好。 第二部分是对Bt YBT1520所在的Bc群分类进化分类分析，及具体指标16S rDNA的分析。对于具体分类指标16SrDNA，研究策略是以NCBI数据库中已有Bc群中的8株成了完成了基因组序列测定菌株。这8株蜡状芽胞杆菌群菌株98条16s rDNA的相互之间进行Blast比较，发现在同一基因组内各个16S rDNA拷贝全局相似度最低为99.27％，其中，在蜡状芽胞杆菌ATCC 10987基因组中，有一条16S rDNA很特殊，比其它的要长约50bp，不考虑这条序列该基因组16S rDNA全局相似度为99.73％，考虑这条序列则为96.47％。在不同基因组间16S rDNA局部片段比对最小相似度达到99..72％，对应片段长度也有1417bp。数据显示，该群的细菌完全共用同一种16S rDNA，根据16S rDNA给细菌分类的特点，它们应该属于同一个种(Species)。在亲缘关系上发现，枯草芽胞杆菌与蜡状芽胞杆菌群最近。而且进一步研究RNA操纵元发现：Bc群的细菌RNA操纵元数目在细菌中最高，反映了其强劲的生态适应能力。在空间位置上，RNA操纵元分布在复制起点两端，其中在负链5'-3'一端只有一个RNA操纵元，而正链5'-3'一端有许多RNA操纵元。

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文摘

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论文说明：缩略语

声明

1.苏云金芽胞杆菌YBT1520 WGS法项目空洞的拼接

1.1前言

1.1.1 Bc群基因组学进展

1.1.2苏云金芽胞杆菌YBT-1520

1.1.3 WGS法方法简要流程和其中的生物信息学

1.1.4苏云金芽胞杆菌菌株YBT-1520测序项目

1.2材料和方法

1.2.1末端测序法及使用仪器简介

1.2.2序列拼接流程及使用软件

1.2.3基因组组装和拼接的核心算法

1.2.4特定引物的设计

1.2.5模板的选取及反应流程的控制

1.3结果和分析

1.3.1正常和特异contig的估计和区分

1.3.2不同层次的contig补洞工作

1.3.3高拷贝质粒的高覆盖

1.3.4产生重复序列的主要原因

1.3.5模板的使用效率问题

1.3.6参考序列的设定和现阶段八个contig的分析

1.4讨论

1.4.1染色体组文库和高拷贝质粒文库分开

1.4.2 WGS法和克隆逐步测序法的比较

1.4.3主要重复序列问题的解决办法

1.4.4参考序列的恰当应用

2：蜡状芽胞杆菌群的进化分类及16S rDNA分子指标分析

2.1前言

2.1.1细菌系统分类鉴定综述

2.1.2 16S rDNA作为细菌的分类鉴定指标已经被广泛应用

2.1.3 Bc群分类的进展

2.2材料和方法

2.2.1从NCBI数据库中获取微生物基因组数据

2.2.2本地化BLAST方法

2.2.3具体比对的方法

2.3结果和分析

2.3.1 Bc群中16S rDNA相似度

2.3.2蜡状芽胞杆菌群中基因组上RNA操纵元的数量在全体细菌基因组中为最高之一

2.3.3 Bc群中RNA operon在基因组上的位置信息

2.3.4 YBT1520基因组16S rDNA分析

2.4总结和展望

2.4.1蜡状芽胞杆菌群细菌基因组上的16S rDNA可以做全体的代表

2.4.2蜡状芽胞杆菌群中应该属于同一种

2.4.3枯草芽胞杆菌是在亲缘关系上离蜡状芽胞杆菌群最近的菌株

2.4.4细菌进化分类方面蛋白指标选取的考虑

参考文献

致谢

附录