牛型分枝杆菌四种特异性蛋白嵌合体在诊断中的应用

摘要

本文论述了牛型分枝杆菌四种特异性蛋白嵌合体在诊断中的应用，全文主要内容如下： 1．牛型分枝杆菌cfp10-esat-6融合基因的克隆及表达。 应用PCR方法从牛分枝杆菌临床分离株基因组中扩增获得cfp-10和esat-6四个目的基因片段，通过引入一段Linker序列构建cfp10-esat-6融合基因；并且克隆入表达质粒pET-28a(+)。经测序确认，转化大肠杆菌BL21，经IPTG诱导，成功表达了具有良好抗原性的CFP10-ESAT-6融合蛋白。 2．牛型分枝杆菌MPB70-MPB83-CFP10-ESAT-6融合蛋白的表达。 应用PCR方法从牛型分枝杆菌临床分离株基因组中扩增获得mpb70、mpb83、eft10和esat-6四个目的基因片段，测序鉴定序列的正确性。采用重叠延伸剪接技术(splicing by overlap extension， SOE)获得融合基因cfp10-esat-6和mpb83-cfp10-esat-6，将mpb70和mpb83-cfp10-esat-6串连于载体pUC19-Link上，再将mpb70-mpb83-cfp10-esat-6连于表达载体pET28a(+)中得到重组质粒0ET-28a-MPB70-MPB83-CFP10-ESAT-6。转化BL21(DE3)大肠杆菌感受态细胞，经IPTG诱导获得可溶性表达的融合蛋白。用Ni<'++>亲合层析柱纯化该融合蛋白。ELISA及Western blot鉴定融合蛋白的免疫活性，热处理法分析蛋白的热稳定性。经EIASA验证该融合蛋白能分别与抗原蛋白MPB70、MPB83和CFP10-ESAT-6的多抗反应，说明该融合蛋白具有单个抗原的免疫学活性。Western blot分析显示，该融合蛋白能与抗牛型分枝杆菌阳性血清发生特异性反应，而与其它非相关抗原的阳性参考血清如牛副结核病、牛布氏杆菌病、牛巴贝斯病和牛传染性鼻气管炎病阳性血清等不反应。热稳定性试验证明该融合蛋白为一种热稳定性好的蛋白。通过基因工程融合表达了牛型分枝杆菌的四种特异性抗原蛋白，该蛋白具有单个蛋白的免疫原性和稳定性，作为一种新型的诊断抗原具有良好的应用前景。 3．牛结核病EIASA抗体检测方法的临床应用。 大肠杆菌原核表达MPB70-MPB83．CFP10-ESAT-6融合抗原，进行纯化与鉴定后，以此为诊断抗原建立了牛结核病间接ELISA．抗体检测(iELISA)的诊断方法。数据结果用血清样本与阳性对照和阴性对照的OD<,630>相对值(S/P)表示，用90份健康牛血清检测结果确定阴阳性临界值S/P为0.17。iEIISA与常见非相关牛病的参考阳性血清无交叉反应。 以结核菌素皮肤试验(TST)为参考方法，检测了华中地区四个奶牛场的560头黑白花奶牛。在所检测的560份血清中，iELISA阳性105份，阴性455份；TST阳性76份，阴性484份；两种方法共同检出阳性样本55份，共同检出阴性样本434份，总符合率为87.32％。以TST为金标准，则iELISA的敏感性为72.37％(55/76)，特异性为89.67％(434/484)。另外，又用iELISA、胶体金试纸条(CGST)和细菌培养平行检测了其中150头黑白花奶牛。iELISA与CGST的符合率为93.33％(140/150)，采集其中22头奶牛鼻拭子分菌培养，iELISA与细菌培养的符合率为77.27％(17/22)。对这22头皮试阳性牛进行跟踪检测，第一次检测抗体阳性率为36％(8/22)，7个月后再次采样，22头阳性牛中有6头已被淘汰，其余16头抗体检测均为阳性，检出率为100％(16/16)，表明牛型分枝菌感染诱导的体液免疫反应滞后于细胞免疫反应。检测来自湖北武汉地区和宜昌地区共计1014份血清样品，其中阳性167份，阴性血清847份，总体阳性率为16.47％。不同牛场间阳性率差异很大，从0％-65％不等。总体上小型养殖场(<100头)阳性率较高，部分奶牛场结核污染严重；大型养殖场阳性率较低。 进一步检测了来自于中国30个省市的1344份奶牛血清，结果表明牛型分枝杆菌血清抗体阳性率平均为1.60％，范围从0％-20％，表明牛型分枝菌感染呈现地方流行性趋势。

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第1章文献综述

1.1结核分枝杆菌的细菌学与基因组特征

1.1.1细菌学特征

1.1.2基因组特征

1.2结核分枝杆菌蛋白质抗原分研究概况

1.2.1全菌菌体蛋白质

1.2.2膜蛋白(脂蛋白成分)

1.2.3分泌蛋白

1.3细菌蛋白的免疫学研究进特征

1.3.1菌体蛋白类

1.3.2分泌蛋白类

1.3.3其它相关重要蛋白

1.4主要蛋白抗原的特性

1.4.1 CFP系列蛋白

1.4.2 ESAT-6家族蛋白

1.4.3 MPB系列蛋白

1.4.4抗原85复合蛋白质(Ag85)

1.4.5 DnaK、GroEL、GroES蛋白

1.4.6脂蛋白

1.5结核分枝杆菌特异性抗原

1.5.1在人体中的研究

1.5.2在牛中的研究

第2章牛型分枝杆菌cfp10-esat-6融合基因的克隆及表达

2.1研究目的和意义

2.2材料与方法

2.2.1材料

2.2.2方法

2.3结果与分析

2.3.1 pET-28a-CFP10-ESAT-6的克隆

2.3.2重组质粒的双酶切鉴定

2.3.3表达产物的SDS-PAGE分析

2.4讨论

2.4.1 pET-28a-CFP10-ESAT-6重组质粒的构建

2.4.2 CFP10和ESAT-6蛋白的生物学性质

2.4.3 CFP10-ESAT-6融合蛋白的诊断应用研究

2.5小结

第3章牛结核病四种蛋白嵌合体抗体ELISA抗体检测方法的临床应用

3.1研究目的和意义

3.2材料与方法

3.2.1材料

3.2.2方法

3.3结果

3.3.1 临界值的确定

3.3.2 iELISA的交叉反应检测

3.3.3 iELISA与TST的结果比较

3.3.4 iELISA与胶体金试纸条商品试剂盒检测的结果比较

3.3.5 iELISA与细菌分离培养的结果比较

3.3.6湖北武汉和宜昌地区流行病学调查

3.3.7全国30个省市流行病学调查

3.4讨论

参考文献

致谢

附录

硕士期间发表论文及研究成果