猪七个候选印记基因的分离、印记鉴定及其与性状的关联分析

摘要

基因组印记是指二倍体生物的某些组织或细胞中，来源于不同亲本的一对等位基因发生差异性表达，即只有一方亲本的等位基因表达，而另一亲本的等位基因不表达或很少表达的生物学现象，而相应的基因就称为印记基因。对哺乳动物的研究表明，印记基因在胎儿、胎盘的生长发育及胎儿出生后的表现等方面，都发挥着重要的调节作用。目前，对基因组印记的研究主要集中在人和小鼠中，在家畜特别是猪中研究比较少。因此在猪中鉴定印记基因对于基因组印记在物种间的保守性研究具有重要意义。另外，大部分己研究的印记基因都是重要的调控基因，包括转录因子，细胞周期调节基因，生长因子或者是参与复杂的信号通路。基于印记基因在生长和发育中的重要调控作用，预测这些基因可能对猪等家畜动物的生产性状产生较大的影响。因而，在育种中能否将印记基因作为分子标记进行标记辅助选择，是一个值得探讨的新课题。所以本研究主要进行了以下两个方面的工作：(1)利用大白猪×梅山猪和梅山猪×大白猪正反交模型，通过RT-PCR-RFLP 分析和 PCR 产物直接测序法检测“表达的SNP”，鉴定了猪7个候选印记基因的印记状态，以期探讨基因组印记在猪与其他物种间的保守性；(2)在大白猪×梅山猪 F<,2> 代群体中，利用PCR-RFLP技术，进行了4个猪候选印记基因的基因型与重要经济性状的关联分析，以期探讨印记基因在育种中作为分子标记的可行性。目前，取得了如下结果： 1．根据人和小鼠印记基因的印记状况及生理功能，筛选了PLAGL1、PEG10、PPP1R9A、XIST、MEST、NAP1L5和PEG3基因作为猪候选印记基因。利用电子克隆和比较基因组学方法获得了7个候选印记基因的cDNA序列，其中3个基因包括完整的ORF；(1)PLAGL1，获得cDNA序列2238bp，其中开放阅读框(Open reading frame，ORF)为1392bp，GenBank登录号为。DQ28899；(2)PEG10，获得cDNA序列6379bp，其中ORF为1212bp，GenBank登录号为DQ779285；(3)PPP1R9A，获得cDNA序列1946bp，GenBank登录号为EF619476；(4)XIST，获得cDNA序列1039b，GenBank登录号为EF619477；(5)MEST，获得cDNA序列2167bp，其中ORF为981bp，GenBank登录号为EF619473；(6)NAP1L5，获得cDNA序列1158bp，GenBank登录号为EF619474；(7)PEG3，获得cDNA序列2052bp，GenBank登录号为EF619475。比较了所获得的7个候选印记基因cDNA序列与人和鼠同源序列的相似性，表明7个基因cDNA序列的猪．人相似性均大于猪一鼠相似性和人．鼠相似性。 2．对所获得的猪7个候选印记基因的cDNA序列，在3头大白猪和3头梅山猪问进行了比对分析：(1)PLAGL1，在CDS和3’UTR各发现1个SNP，全为转换突变；(2)PEG10，在3’UTR发现4个SNP，其中3个转换突变，1个插入/缺失突变；(3)PPP1R9A，在3’UTR发现8个SNP，其中4个转换突变，3个颠换突变，1个插入/缺失突变；(4)XIST，在3’UTR发现4个SNP，其中3个转换突变，1个插入/缺失突变；(5)MEST，在3’UTR发现2个SNP，全为转换突变；(6)NAP1L5，在3’UTR发现2个SNP，其中1个转换突变，1个插入/缺失突变；(7)PEG3，在3’UTR发现3个SNP，其中1个转换突变，2个插入/缺失突变。 3．利用大白猪×梅山猪和梅山猪×大白猪正反交模型，通过RT-PCR-RFLP 分析和 PCR 产物直接测序法，鉴定了7个候选印记基因在二月龄猪14个组织和器官中的印记状况。结果表明，虽然7个候选基因的印记状况在不同组织间有些差异，但从总体来看，它们在人、小鼠和猪中是趋于保守的。 4．利用PCR-RFLP技术，对4个候选印记基因中存在的SNP位点在不同猪群中进行了基因分型，并在大白×梅山F<,2>代群体中进行了性状关联分析。结果表明，将印记基因特别是位于性染色体上的XIST 基因，作为分子标记应用于育种实践中，具有非常好的前景。

目录

声明

摘要

第一章前言

1基因组印记的研究进展

1.1基因组印记的发现

1.2印记基因的特征

1.3基因组印记的分子机制

1.4基因组印记与疾病

1.5印记与进化

1.6印记的检测方法

2基因组印记与动物遗传育种

2.1印记基因的生理功能

2.2在家畜中鉴定的印记基因

2.3印记与动物克隆

2.4印记与数量性状的关系

3拟分离候选印记基因的研究现状

3.1 PLAGL1基因

3.2 PEG10基因

3.3 PPP1R9A基因

3.4XIST基因

3.5 MEST基因

3.6 NAP1L5基因

3.7 PEG3基因

4研究的目的和意义

第二章材料和方法

1实验材料

1.1 DNA与RNA样品

1.2主要仪器与设备

1.3工具酶或主要试剂、培养基及试剂盒

1.4常用试剂及其配制

1.5常用的生物信息学网站和分析软件

2实验方法

2.1猪基因组DNA的提取

2.2总RNA的提取及cDNA的制备

2.3猪候选印记基因的确定

2.4 EST拼接和引物设计

2.5 PCR及PCR-RFLP分析

2.6 PCR产物的纯化、克隆和测序

2.7印记分析

2.8多态性分析和SNP与性状的关联分析

第三章结果与分析

1总RNA的提取与cDNA的制备

1.1总RNA的提取

1.2 cDNA的制备与检测

2 7个候选印记基因的分离、印记鉴定和性状关联分析

2.1猪PLAGL1基因

2.2猪PEG10基因

2.3猪PPP1R9A基因

2.4猪XIST基因

2.5猪MEST基因

2.6猪NAP1L5基因

2.6猪PEG3基因

第四章讨论

1关于候选印记基因的筛选

2关于EST的电子克隆

3猪与人、鼠间印记基因编码区序列的保守性

4基因印记的分析方法

4.1基于“表达的SNP”的分析方法

4.2应用品种间杂交模型分析基因组印记的高效性

5 7个候选基因印记状况在物种间的保守性

6基因组印记与营养冲突假说

7将印记基因作为分子标记应用于育种实践中的前景

7.1印记基因作为分子标记的遗传效应

7.2印记基因作为分子标记的展望

小结

参考文献

附录

在读期间已发表的论文题录

致谢