猪2型链球菌间接ELISA和间接血凝抗体检测方法的建立及应用

摘要

本课题的研究目的： 1.建立以猪2型链球菌荚膜多糖为抗原的间接ELISA检测方法。 2.构建溶血素基因的原核表达质粒，并分析表达产物的免疫反应性，建立以溶血素为靶蛋白的猪链球菌间接血凝(IHA)抗体检测方法。 3.以上述两种方法对临床上送检血清进行检测，验证建立的两方法的符合率，并分析最近一年内我国猪2型链球菌的流行病学特点。 猪2型链球菌能产生多种毒力因子，常见的有荚膜多糖(CPS)、溶菌酶释放蛋白(Muramidase-released protein，MRP)、胞外因子(Extracellular factor,EF)，溶血素(Suilysin，SLY)等，其中CPS是最早被证实的猪2型链球菌毒力因子，也是进行分型的依据，采用改良的kodana方法提取猪2型链球菌的荚膜多糖，并以此作为抗原建立间接ELISA抗体检测方法，对各方面条件进行优化，研制出猪2型链球菌间接ELISA抗体检测试剂盒。另外发病猪的猪2型链球菌中有相当高比例的菌株表现出溶血素活性，因而猪2型链球菌溶血素被认为是该菌主要的毒力因子。根据猪2型链球菌溶血素基因序列设计一对特异性引物，采用PCR扩增猪2型链球菌LT-1分离株溶血素基因，将扩增产物克隆到pMD18-T质粒载体中，酶切和PCR鉴定后测序鉴定。结果显示，扩增的LT-1株溶血素基因长度为1494bp，编码497个氨基酸。将溶血素基因克隆入表达载体pET-28a中，提取重组质粒进行PCR和酶切鉴定，筛选阳性克隆，用SDS-PAGE电泳和Western blot进行溶血素的表达和鉴定。结果表明表达产物具有免疫反应性。然后以表达的溶血素蛋白为抗原致敏绵羊红细胞，并对各方面条件优化，建立猪链球菌间接血凝试验(IHA)。 采用间接ELISA方法检测从河南、安徽、江西、湖南、湖北、福建、广东、广西和北京等地送检的血清样品共3991份，结果表明阳性率分别为33.75％，41.6％等，各省血清样品阳性率从0％到41.6％。本研究建立的两种检测方法操作简单、特异性强、敏感性高并适用于猪链球菌的抗体检测和流行病学调查。

目录

论文说明：缩略语表

声明

摘要

第一章前言

1猪2型链球菌的血清型

2猪2型链球菌的毒力因子

2.1荚膜多糖

2.2溶菌酶释放蛋白和胞外蛋白因子

2.3溶血素

2.4黏附素

2.5 IgG结合蛋白

3猪2型链球菌病流行病学

3.1病原特性

3.2流行病学特性

第二章猪2型链球菌间接ELISA试剂盒研制及应用

1研究目的与意义

2试验材料

2.1菌种

2.2血清及酶标二抗

2.3 ELISA主要试剂

2.4 ELISA相关溶液的配制

3方法

3.1荚膜多糖的制备及定量

3.2抗原最佳包被浓度和血清最佳稀释度的确定

3.3封闭液的确定

3.4血清稀释液的确定

3.5血清最佳反应时间的确定

3.6酶标抗体反应时间的确定

3.7底物的最佳反应时间的确定

3.8 ELISA操作程序

3.9敏感性试验

3.10特异性试验

3.11重复性试验

3.12保存期试验

3.13破坏性试验

3.14 ELISA判定标准的确定

4结果与分析

4.1荚膜多糖的浓度

4.2抗原最佳包被浓度和血清最佳稀释度的确定

4.3封闭液的确定

4.4血清稀释液的确定

4.5血清最佳反应时间的确定

4.6酶标抗体反应时间的确定

4.7底物的最佳反应时间的确定

4.8敏感性试验

4.9特异性试验

4.10重复性试验

4.11保存期试验

4.12破坏性试验

4.13 ELISA判定标准的确定结果

4.14流行病学调查与分析验证

5讨论

5.1猪2型链球菌

5.2酶联免疫吸附试验(ELISA)

5.3小结

第三章猪链球菌间接血凝试验方法建立及应用

1研究目的与意义

2试验材料

2.1菌种及质粒

2.2血清

2.3主要药品及试剂

2.4主要试剂及溶液的配制

3试验方法

3.1 SLY基因的扩增表达

3.2红细胞的制备

3.3抗原致敏

3.4间接血凝试验

4结果

4.1 SLY基因的PCR扩增、克隆及序列测定

4.2 SLY表达载体的构建与鉴定

4.3 SLY表达产物的SDS-PAGE及Western-blot结果

4.4间接血凝最佳工作条件的确定

4.5分析

5讨论

5.1间接血凝试验

5.2间接血凝试验优点

5.3小结

参考文献

致谢