有机磷农药残留酶联免疫直接竞争检测技术的研究

摘要

农药残留是危害食品安全的重要因素之一，其中有机磷农药是目前使用最为广泛的一类农药，约占农药总使用量的70％，因此对有机磷农药的检测是食品安全检测的重要内容。目前用来检测有机磷农药的方法主要是气相色谱(GC)和高效液相色谱(HPLC)，这些方法前处理步骤复杂，费时费力，设备昂贵，需要专业人员操作，适宜实验室检测，不适宜大量样品现场快速检测。 酶联免疫吸附分析(Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)方法快速、灵敏、选择性好，具有检测成本低，操作简便，安全可靠等优点，同时还适宜痕量物质的检测。近年来，有关农药的免疫检测方法已有一些报道，但多数为间接酶联免疫法。因此本实验研究直接竞争酶联免疫分析方法检测有机磷农药的技术，旨在用一步抗原抗体反应，快速的检测半抗原，方法简便，灵敏度高。 本论文选取国家明令禁止使用的甲胺磷、甲基对硫磷、对硫磷三种高毒、高残留的有机磷杀虫剂为研究对象。根据其结构特点，首先合成了农药的半抗原，然后将半抗原与载体蛋白牛血清蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)偶联合成免疫原和酶标抗原。 用合成的免疫原免疫兔子后获得多克隆抗体，用间接ELISA测定三种抗体的效价分别为1：4000、1：4500、1：6000。并且与其他主要的有机磷农药进行交叉反应试验，试验表明交叉反应率都很低。通过直接竞争ELISA检测，确定甲胺磷、对硫磷、甲基对硫磷包被原(即抗体)和酶标抗原的最佳工作浓度分别为1：2000、0.001mg/mL，1：3000、0.01mg/mL，1：2000、1mg/mL以及三种农药的方法检测限分别达到0.01μg/mL、1μg/mL和0.01μg/mL，实验回收率均达到96％以上，并且与GC有很好的符合率。三种农药直接竞争ELISA方法的板内变异系数均低于5％，板问变异系数均低于15％。表明该方法有很好的稳定性。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章前言

1.1国内外食品安全现状

1.1.1国际食品安全的现状

1.1.2国内食品安全现状

1.2有机磷农药残留现状及其危害

1.3有机磷农药残留检测方法及快速检测技术的应用现状

1.3.1发光菌检测技术

1.3.2化学发光技术

1.3.3免疫分析技术

1.3.4生物传感器技术

1.3.5生物芯片技术

1.4农药残留酶免疫分析技术的国内外研究现状

1.5本试验的内容、目的及意义

第二章免疫原及抗血清制备

2.1材料

2.1.1试剂与仪器

2.1.2实验动物

2.1.3溶液系统

2.2试验方法

2.2.1免疫原的合成

2.2.2抗血清制备

2.2.3抗血清纯化

2.2.4抗血清滴度测定

2.2.5亲和常数的测定

2.2.6抗血清特异性测定

2.2.7抗血清的保存

2.3试验结果与分析

2.3.1甲胺磷免疫原的制备

2.3.2对硫磷与甲基对硫磷免疫原合成

2.3.3抗血清效价测定结果

2.3.4抗血清亲和常数的计算

2.3.5抗血清特异性试验结果

2.4讨论

第三章酶联免疫直接竞争技术的研究

3.1材料

3.2直接竞争酶联免疫分析技术建立

3.2.1直接竞争ELISA原理和测定程序

3.2.2酶标半抗原合成

3.2.3抗体、酶标抗原最佳工作浓度的选择

3.2.4直接竞争酶联免疫方法的标准曲线的建立

3.2.5方法的特异性

3.2.6样品的回收率试验及方法对比

3.2.7方法的精密度试验

3.2.8方法的稳定性试验

3.2.9样品前处理

3.3结果与分析

3.3.1酶标半抗原的制备

3.3.2抗体、酶标抗原最佳工作浓度

3.3.3直接竞争ELISA检测方法标准曲线的建立

3.3.4特异性试验结果

3.3.5回收率及对比试验结果

3.3.6直接竞争酶联免疫分析方法的精密度试验结果

3.3.7方法的稳定性

3.4讨论

第四章直接竞争ELISA试剂盒的研制

4.1材料与方法

4.1.1试剂盒内容及制备

4.1.2仪器设备

4.1.3试剂盒操作方法及结果判定

4.2试剂盒使用的注意事项

4.3讨论

第五章结论

参考文献

致谢

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