灵芝产漆酶条件的优化与漆酶的纯化及部分性质研究

摘要

本试验对灵芝产漆酶条件进行研究,确定其产酶培养基的最佳碳源及最优碳源浓度,最佳氮源及最优氮源浓度,最佳起始pH值,以及产漆酶最佳诱导金属离子及其最优浓度,以筛选出的四个培养条件为四个因素,分别设定五个作用水平,通过旋转正交实验得到最佳培养基组成为(g/L):葡萄糖3％,酵母浸膏0.1％,KH2PO40.3％;MgSO4·7H2O0.1％:Cu2+2.854mmol/L;VB10.01％;高压灭菌后pH为2.60。试验通过真空抽滤、(NH4)2SO4分级沉淀、透析、聚乙二醇6000浓缩、磷酸盐缓冲液(0.01mol/L,pH5.8)为洗脱液的DEAE-cellulose阴离子交换层析柱(1.6cm×40cm)层析等步骤对粗酶液进行了纯化。
　　用紫外分光光度计测定收集液在280nm处的吸光值,并对有吸收峰的收集液进行了漆酶酶活检测,确定洗脱液盐浓度为0.2mol/L NaCl时可分离得到漆酶,在此基础上采用SDS-PAGE电泳对所得漆酶进行纯度鉴定,试验结果表明最终纯化倍数达3.6,活力回收率为49.1％。试验确定了纯化的灵芝漆酶的部分酶学性质。
　　纯化漆酶的分子量约为45KDa;纯化漆酶最适作用温度为75℃,在40℃-65℃之间热稳定性较好,对70℃以上的高温敏感;纯化漆酶的最适反应pH范围为3.0-3.6,在pH3.0-5.0之间酸碱稳定性较好,pH值越高漆酶越不稳定;金属离子对纯化漆酶活力的影响很大,当金属离子浓度为50mmol/L时,Na+和Zn2+对漆酶活性无明显影响,Cu2+、Mn2+和Mg2+对漆酶活性有明显的促进作用,而Ag+和Fe2+离子对漆酶酶活有强烈的抑制作用。其中Cu2+的激活作用最好,Ag+的抑制作用最强烈;30℃时,灵芝漆酶氧化2,2’-连氮基-二-(3-乙基苯并噻锉-6-磺酸)(ABTS)的米氏常数Km值为186μmol/L。

目录

摘要

Abstract

第一章 文献综述

1.1 漆酶来源、特性及催化反应机理

1.1.1 漆酶的主要来源

1.1.2 漆酶的化学组成和结构

1.1.3 漆酶催化反应机理

1.2 漆酶研究进展

1.2.1 漆酶的底物和介质系统的作用机理

1.2.2 漆酶发酵条件的研究

1.2.3 漆酶蛋白纯化的研究

1.2.4 漆酶的分子生物学研究

1.3 漆酶的应用前景

1.3.1 漆酶在制浆造纸中的应用

1.3.2 漆酶在生物治理中的作用

1.3.3 漆酶在高分子化合物合成中的作用

1.3.4 漆酶在生物传感器中的应用

1.3.5 漆酶在食品工业中的应用

1.4 本研究的目的与主要内容

第二章 灵芝产漆酶条件的优化

2.1 材料与方法

2.1.1 菌种

2.1.2 试剂

2.1.3 使用仪器

2.1.4 培养基的配制

2.1.5 分析方法

2.2 结果与分析

2.2.1 最佳碳源的筛选及其浓度的确定

2.2.2 最佳氮源的筛选及其浓度的确定

2.2.3 最佳初始pH值的确定

2.2.4 金属离子对灵芝产漆酶的影响

2.2.5 最佳Cu~(2+)浓度的确定

2.2.6 旋转正交法优化灵芝产漆酶培养基

2.3 讨论

第三章 灵芝漆酶的分离纯化

3.1 材料与方法

3.1.1 菌种

3.1.2 试剂

3.1.3 使用仪器

3.1.4 培养基

3.1.5 分析方法

3.2 结果与分析

3.2.1 样品纯化结果

3.2.2 漆酶纯度的鉴定和分子量的测定

3.3 讨论

第四章 灵芝漆酶部分性质研究

4.1 材料与方法

4.1.1 菌种

4.1.2 试剂

4.1.3 使用仪器

4.1.4 培养基

4.1.5 方法

4.2 结果与分析

4.2.1 漆酶蛋白分子量的测定

4.2.2 温度对漆酶活性的影响及热稳定性

4.2.3 pH值对漆酶活性的影响及其酸碱稳定性

4.2.4 金属离子对漆酶活性的影响

4.2.5 漆酶的米氏常数

4.3 讨论

第五章 结论

参考文献

攻读学位期间发表的学位论文

致谢