感染猪链球菌2型后细胞因子的变化以及分泌核酸酶A的生物学研究

摘要

猪链球菌(Streptococcus suis,S.suis)是一种重要的人畜共患病原菌。根据荚膜多糖(capsular polysaccharide,CPS)抗原成分不同,可以将猪链球菌分为35个血清型(1—34型和1/2型)。其中猪链球菌2型(Streptococcus suis type2,SS2)是最常见也是毒力最强的血清型。猪链球菌2型不仅可引起猪脑膜炎、关节炎、心内膜炎、败血症、肺炎和突然死亡,还可感染相关人员并致死。有报道表明,一些炎性因子和趋化因子的超量表达与细菌导致的脑膜炎症有关。而猪链球菌2型引起血液中大量细胞因子的表达,可能也是猪链球菌2型突破血脑屏障的可能机制之一。
　　本实验利用荧光定量PCR定量IL-1α,IL-1β,TNF-α,IL-8,IL-10,IFN-γ等细胞因子的表达情况,并分析感染猪链球菌2型后这些细胞因子的表达差异情况。结果显示,与IL-1β和IL-10相比,IL-1α,TNF-α,IL-8和IFN-γ有很大程度的升高,IL-1β在整个检测过程中多比较弱,TNF-α在9H就开始升高,在42H达到顶峰。IL-8在攻毒后即有明显的升高。通过这个分析,我们希望能为解释猪链球菌2型的致病特征提供一定的理论信息。为更好的防治猪链球菌2型提供理论基础。猪链球菌的致病性与其毒力因子相关,目前猪链球菌的毒力因子主要有溶菌酶释放蛋白、胞外因子、溶血素、荚膜多糖等。近年来,还发现了一些潜在的毒力因子,主要有:分泌核酸酶(Secreted Nuclease A,SsnA)、38KD免疫保护性抗原、致病性基因-orf2等。研究表明,分泌核酸酶A(SsnA)的表达水平和分离的位置有密切大关系。即深层组织分离的细菌大部分表现为SsnA阳性,而浅层组织分离菌则表现为阴性。针对这一现象,推测SsnA蛋白可能可以作为区分猪链球菌感染已否的一个指标。本实验针对SsnA这一特点,克隆表达了SsnA蛋白,经蛋白纯化,可达浓度90％。利用纯化的SsnA蛋白建立ELISA方法,来区分猪链球菌感染和免疫。结果显示,将384份免疫阳性血清用SsnA包被的ELISA板(SsnA-ELISA)检测,共有88份血清OD630>0.4,即为阳性,阳性率为22.9％。而在37份感染的血清中,用荚膜多糖(CPS)检测均为阳性。用SsnA纯化蛋白包被的ELISA检测,有30份血清OD630>0.4,阳性率为81.1％。结果初步说明,SsnA是可以作为猪链球菌区分感染与免疫的一个指标。

目录

摘要

Abstract

缩略语表(Abbreviation)

第一章 猪链球菌2型的研究进展

1 病原学

2 流行病学

3 毒力因子

3.1 荚膜多糖

3.2 溶菌酶释放蛋白(MRP)和胞外因子(EF)

3.3 猪链球菌溶血素(suilysin)

3.4 黏附素

3.5 IgG结合蛋白

3.6 纤维蛋白原结合蛋白(FBPS)

3.7 其它毒力相关因子

4 致病机理

5.猪链球菌的鉴定

5.1 生化鉴定

5.2 血清学鉴定

5.3 分子鉴定

6.预防和治疗

7.协同性致病因子

第二章 感染猪链球菌2型后猪外周血细胞因子的变化

1 前言

2 材料和方法

2.1 材料

2.2 方法

3 结果

3.1 猪的临床症状

3.2 cDNA PCR扩增鉴定和RNA样品中DNA检测

3.3 荧光定量PCR的融解曲线

3.4 荧光定量PCR扩增细胞因子结果

4 讨论

4.1 DNA的定量的研究

4.2 各个细胞因子mRNA的表达

5 小结

第三章 分泌核酸酶(SsnA)的生物学特性研究

1 前言

2 材料和方法

2.1 材料

2.2 方法

3 结果

3.1 SsnA的克隆,连接和鉴定

3.2 重组SsnA的表达及Western blot鉴定

3.3 重组SsnA蛋白的纯化

3.4 重组SsnA蛋白的保护力效果测定

3.5 ELISA方法的初步建立

3.6 实时荧光定量PCR检测免疫小鼠脾细胞中IFN-γmRNA表达

3.7 35个血清型SsnA基因PCR扩增

3.8 SsnA基因突变体质粒鉴定

4 讨论

4.1 SsnA的蛋白纯化

4.2 分泌核酸酶A(SsnA)作为区分猪链球菌感染与免疫的指标

5 小结

参考文献

致谢