棉花体胚同步发生及相关基因表达和蛋白磷酸化分析

摘要

体细胞胚胎发生是体细胞向胚胎发生途径转变的发育再建过程，也是植物全能性预言的最好说明。体细胞胚发生现象被看作是开展生物学理论研究的良好模型。研究棉花体细胞胚发生对于阐明植物发育的分子机理，促进作物的遗传工程改良，无论在基础理论还是在实际应用价值上都具有极其重要的意义。以陆地棉品种Coker201为材料，对体细胞胚发生过程中的同步控制技术、组织细胞学、基因表达、蛋白质表达和磷酸化、酪蛋白激酶活性以及蛋白质双向电泳技术等进行了研究。研究结果如下： 1.棉花体细胞胚胎发生的频率低，且体细胞胚的发育存在着不同步性，给体细胞胚胎发生发育过程的生理学、生物化学和分子生物学的研究带来许多困难。以陆地棉品种Coker201为材料，首先筛选了适合体细胞胚胎发育的培养基配方，然后以此培养基为基本培养基，建立了一种简单有效的棉花体细胞胚高频率发生和同步发育的培养体系。经过多次继代获得的胚性愈伤首先在液体培养基中振荡培养2d使其分散，然后过30目筛去除大的颗粒，重新悬浮于同样的液体培养基中。悬浮培养14d后，过50目筛，将筛上的胚性愈伤重悬浮于新鲜的培养基中，并用吸管吸取悬浮液，将其均匀地接种在表面垫有滤纸的同成分固体培养基(附加2.46μmolL-1IBA和0.70μmolL-1kinetin)上。培养21d后，用挚有滤纸的相同的固体培养基继代培养。利用这种培养体系，获得的体细胞胚数量分别是单纯悬浮培养和固体培养(不垫滤纸)的16.5倍和4倍。其中，球形胚、鱼雷形胚和子叶胚的同步发生率分别为70.2％、52.3％和73.0％。 2.以陆地棉品种Coker201下胚轴为外植体诱导愈伤组织，并以介于30-50目筛之间的胚性愈伤细胞团为材料进行单个细胞团培养，采用石蜡切片法观察棉花愈伤组织诱导和分化过程及体细胞胚发生和发育过程。结果显示棉花胚性愈伤组织有下胚轴两端发生、内发生、非胚性细胞转化、外发生和腺体处发生5种形成途径，其中两端发生和内发生是主要的形成方式，都是由下胚轴形成层细胞直接分化产生；棉花体细胞胚存在单细胞起源，多为表面发生，少量为内发生，并经历球形胚、心形胚、鱼雷形胚、子叶胚4个过程，与合子胚形成过程相似。棉花体细胞胚发育过程中最关键的事件似乎是极性的建立、顶端分生组织的形成以及前形成层的分化和生长轴变化。球形胚时期表皮原层的分化标志着体细胞胚结构分化的开始。初始前形成层的形成是体细胞胚形态转变的第一个信号。球形胚内部等径细胞轴向延长，接着前形成层生长轴发生变化，这些是心形胚或椭圆形体胚中的重要事件。鱼雷形胚基本分生组织中液泡的出现开始了组织分化的过程。三种主要的胚性组织系统包括芽顶端分生组织，根顶端分生组织和原形成层束在鱼雷形胚阶段清晰可见。随后鱼雷形胚上层分化形成芽原基和两个叶原基。子叶胚的维管组织从两片子叶伸向胚根，呈V形或Y形。对一些停滞发育的球形胚和鱼雷形胚的解剖检查表明，极性建立可能是决定体细胞胚能否萌发的关键因素。 3.在体细胞胚胎发生和合子胚发育的过程中，无论是胚胎发生的启动还是胚状体的形态建成都受到多种因子的调控，体细胞胚发生是一个由多种基因参与的复杂时空调节的发育途径。本研究从基因表达水平上对体细胞胚胎发生过程中所涉及的基因转录、转录后与翻译后修饰以及糖类、脂类及氨基酸与蛋白质的合成转运与代谢等生化进程进行了一定的分析。在所研究的33个基因中，有25个来自一个棉花的体细胞胚胎发生的SSH文库，这些基因在棉花胚性愈伤和各时期胚状体中有差异表达，另外5个SERK基因和3个CKII基因来源于相关Genebank库。根据qRT-PCR的实验结果，按目的基因的表达最高峰所对应的体细胞胚胎发生阶段可将这些基因分为3类：(1)与体细胞胚起始发生与形态建成相关。供试的基因中几乎所有涉及代谢与转运的基因均在这一阶段出现表达高峰，这与前人研究中体细胞胚发生过程中DNA含量明显增加，RNA合成速率明显提高，mRNA种类丰富，氨基酸含量升高，蛋白质合成活跃的特征是不谋而合的，高水平的脂质转运蛋白更是成为体细胞胚发生的分子标记物质；后转录因子在体细胞胚的形成与发育阶段的高表达预示着其生命过程的复杂性。(2)与体细胞胚发育与成熟相关。从供试的基因表达高峰所对应的胚胎发育阶段来看，体胚与合子胚的发育成熟过程中对后转录因子、CKII、腺嘌呤、氨基酸与类脂物质代谢相关的基因需求量是不一致的。体细胞胚胎发育与成熟要求较高水平的细胞壁相关蛋白基因、腺嘌呤与氨基酸代谢相关基因与CKII基因；以SERK为代表的翻译后修饰基因在体细胞胚发育阶段的高表达被认为是复杂的蛋白质相互作用的标志，证明了体细胞胚的发育和成熟与起始发生和形态建成一样是相当复杂的。(3)与合子胚发育相关。合子胚的发育和成熟要求更高水平的酰基转移酶；除ERT和SCL转录因子是体细胞胚胎发育所特有的，其余转录因子的表达水平在两种类型的胚胎发育过程中没有明显特异之处。这可能与转录因子的DNA结合域所能识别的顺势因子的差异有关。本研究结果首次证实了HMG转录因子和GRP蛋白在植物体细胞胚和合子胚发生发育中及CKII在植物体细胞胚发生发育中的重要作用。APRT编码基因在体细胞胚发育过程中的活跃表达，意味着在高等植物胚胎发生或发育过程中存在核苷酸补救合成途径。本研究还发现一个编码氧化还原酶的基因在胚性愈伤组织中表达极度活跃，可能是该阶段的标记基因。 4.蛋白激酶和磷酸酶主要参与通过蛋白磷酸化和去磷酸化调节的几个细胞事件。这些事件包括细胞生长、分化和细胞代谢。CKI和CKII参与了几种底物的磷酸化。在棉花体细胞胚发生过程中研究了蛋白质的磷酸化和酪蛋白激酶活性。在测试的体细胞胚发生的5个阶段(非胚性愈伤组织、胚性愈伤组织、球形胚、鱼雷胚和子叶成熟胚)观察到许多不同的多肽被磷酸化。外源ATP增强了体细胞胚发生各阶段的蛋白磷酸化作用。冈田酸和矾酸盐在磷酸化反应中的使用增加了蛋白磷酸化水平，这暗示除酪氨酸磷酸酶外，在体细胞胚发生过程各阶段还存在丝氨酸/苏氨酸磷酸酶。实验中采用CKII抑制剂和胶内激酶分析所得结果表明，体细胞胚中存在CKII。 5.棉花愈伤组织和体细胞胚中富含多糖、多酚化合物、脂质、色素和其他干扰物质，因而采用常规方法难以制备高质量的蛋白质样品。对陆地棉品种Coker201的胚性培养物，通过添加PVPP研磨和丙酮、TCA/丙酮、甲醇/醋酸铵等有机溶剂的系列洗涤，然后再进行酚抽提，蛋白质质量得到显著改善，获得的2-DE图谱质量高、可分辩的蛋白质点数多。比较分析3种裂解液对蛋白质的溶解效果发现，在裂解液中混合采用7mol·L-1尿素、2mol·L-1硫脲以及4％CHAPS是有效的。对3种考马斯亮蓝染色方法和4种银染色方法分别进行比较分析，认为由Neuhoff法改进而来的Bluesilver法敏感性比其他考染方法好，稳定性也好；银染色灵敏度高于考马斯亮蓝染色，但由于显色难以掌控因而稳定性差，相比较而言，Mechin银染法表现较好。本实验显示的结果为进一步的研究奠定了基础。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略语表

声明

1 前言

1.1植物体细胞胚发生的研究概况及其意义

1.2植物体细胞胚发生的影响因素

1.2.1植物本身的因素

1.2.2培养基成分

1.2.3培养方式

1.2.4培养条件

1.3植物体细胞胚发生的同步化调控

1.4植物体细胞胚发生的细胞生物学研究

1.5植物体细胞胚发生的蛋白质研究

1.5.1植物体细胞胚发生过程中蛋白质和氨基酸的代谢动态

1.5.2植物体细胞胚发生过程中特异蛋白的研究

1.5.3植物体细胞胚发生过程中蛋白质组学的研究

1.5.4植物体细胞胚发生过程中蛋白质磷酸化和蛋白激酶的研究

1.6植物体细胞胚发生相关基因及其功能的研究

1.6.1植物体胚发生相关特异基因的克隆与表达

1.6.2植物体细胞胚发生过程中的转录谱和相关基因的差异表达

1.7棉花体细胞胚发生机理的研究概况

1.8本项研究的目的与意义

2棉花高效体细胞胚发生及其同步化调控

2.1材料与方法

2.1.1供试材料

2.1.2棉花愈伤组织的诱导和继代培养

2.1.3棉花体细胞胚发生培养基的优化

2.1.4棉花体细胞胚发育的同步化控制

2.2结果与分析

2.2.1陆地棉品种Coker201胚性培养物在继代培养过程中的表现

2.2.2棉花体细胞胚发生培养基的优化

2.2.3陆地棉品种Coker201体细胞胚发生的不同培养方式的比较

2.2.4陆地棉品种Coker201体细胞胚发生的同步调控效果

2.3讨论

2.4结论

3棉花体细胞胚发生过程的组织细胞学观察

3.1材料与方法

3.1.1愈伤组织的诱导和继代培养

3.1.2胚性愈伤组织的悬浮培养

3.1.3胚性细胞团的固体培养

3.1.4石蜡切片制样与观察

3.2结果与分析

3.2.1愈伤组织诱导和分化过程的组织细胞学观察

3.2.2体细胞胚发生过程及其组织细胞学观察

3.3讨论

3.3.1关于胚性愈伤组织的形成

3.3.2关于体细胞胚的起源与发生部位

3.3.3关于体细胞胚的极性建立和器官分化

3.4结论

4棉花体细胞胚发生过程中相关基因的表达

4.1材料与方法

4.1.1植物材料

4.1.2基因来源和PCR引物的设计

4.1.3 RNA提取及纯化

4.1.4 RT-PCR分析

4.1.5实时定量PCR分析(qRT-PCR)

4.2结果与分析

4.2.1所选基因的表达概况

4.2.2几个转录因子和后转录因子基因的表达分析

4.2.3几个脂质转运蛋白基因和相关基因的表达分析

4.2.4几类主要信号分子基因的表达分析

4.2.5 2个细胞壁相关蛋白基因的表达分析

4.2.6几个生理代谢途径相关酶基因的表达分析

4.3讨论

4.3.1关于供试基因的选择和表达

4.3.2转录因子基因在体细胞胚和合子胚发生过程中的差异表达

4.3.3脂质转运蛋白基因在体细胞胚和合子胚发生过程中的差异表达

4.3.4几类主要信号分子基因在体细胞胚和合子胚发生过程中的差异表达

4.3.5细胞壁相关蛋白基因在体细胞胚和合子胚发生过程中的差异表达

4.3.6生理代谢途径相关酶基因在体细胞胚和合子胚发生过程中的差异表达

4.3.7体细胞胚发生过程中基因网络的复杂性

4.4结论

5棉花体细胞胚发生过程中蛋白质磷酸化和酪蛋白激酶活性分析

5.1材料与方法

5.1.1植物材料

5.1.2蛋白质提取

5.1.3 SDS-聚丙烯酰胺电泳(SDS-PAGE)

5.1.4染色和照相

5.1.5体外磷酸化分析

5.1.6酪蛋白激酶活性检测

5.2结果与分析

5.2.1体细胞胚发育过程中可溶性蛋白质含量的变化

5.2.2体细胞胚发育过程中蛋白质表达谱分析

5.2.3体细胞胚发育过程中蛋白质磷酸化分析

5.2.4体细胞胚发育过程中酪蛋白激酶活性的分析

5.3讨论

5.3.1关于磷酸化蛋白的检测

5.3.2体细胞胚发生过程中蛋白质的表达及其磷酸化

5.3.3体细胞胚发生过程中酪蛋白激酶的活性

5.4结论

6棉花胚性培养物蛋白质双向电泳技术体系的建立

6.1材料和方法

6.1.1供试材料及处理

6.1.2化学试剂

6.1.3蛋白质的提取

6.1.4蛋白质的溶解

6.1.5 SDS-聚丙烯酰胺电泳(SDS-PAGE)

6.1.6双向电泳

6.1.7染色和图像扫描

6.2结果与分析

6.2.1不同方法提取的蛋白质的2-DE图谱的比较

6.2.2 4种提取方法的总蛋白产量及其SDS-PAGE分析

6.2.3不同蛋白质裂解液的SDS-PAGE和2-DE图谱的比较

6.2.4不同的考马斯亮蓝染色和银染色方法的染色效果的比较

6.3讨论

6.4结论

参考文献

致 谢

附录：攻读博士学位期间发表的论文