伪狂犬病毒Ea株主要衣壳蛋白之间的相互作用研究

摘要

伪狂犬病(Pseudorabies)又称奥耶斯基氏病(Aujeszky’s disease,AD),是由伪狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)引起的包括多种家畜和野生动物共患的一种急性传染病。伪狂犬病毒基因组全长约150kb,可编码70-100种蛋白,与α-疱疹病毒亚科的其它成员一样,PRV具有潜伏感染和神经嗜性等特征。PRV病毒粒子结构与其它疱疹病毒相似,成熟的病毒粒子由四种结构组成:中心的核含有病毒的线性双链DNA基因组,DNA被包裹在起保护作用的二十面体衣壳中形成核衣壳,衣壳再嵌入到间质结构中,最终在间质外包裹囊膜。几乎PRV所有基因产物的一半都是成熟病毒粒子的结构成分。目前,关于PRV衣壳蛋白的研究都是从HSV-1病毒粒子的研究中推测出来的,推测PRV的衣壳为二十面体结构(150个六邻体和12个五邻体)。其中六邻体含有6个UL19分子和6个UL35分子,形成衣壳边缘和表面;12个五邻体形成衣壳顶角,有11个五邻体是UL19的五聚物,仅第12个顶角是由12个UL6分子形成的圆柱形结构,仅允许一个拷贝的病毒DNA基因组进入衣壳。因此,每一个成熟的衣壳含有955个UL19(VP5)分子、900个UL35(VP26)分子、640个UL18分子(VP23)、320个UL38分子(VP19C)和12个UL6分子(接入蛋白)。衣壳在细胞核中装配,需要六种成熟衣壳的蛋白(UL38、UL35、UL25、UL19、UL18、UL6)和两种框架蛋白(UL26、UL26.5),这两种框架蛋白参与形成衣壳但并不存在于成熟的衣壳中。
　　鉴于以上研究背景,本研究对于PRV衣壳的形成的机制,衣壳的包装、成熟和稳定进行了探索,研究了衣壳蛋白之间的相互作用。主要研究内容如下:1.PRV Ea株UL6、UL18、UL19、UL25、UL26、UL26.5、UL35、UL38的克隆以及序列分析以伪狂犬病毒Ea株基因组DNA为模板,分别PCR扩增UL6、UL18、L25、UL26、UL26.5、UL35、UL38,克隆到pMD18-T载体,并测序。测序结果表明Ea株UL6、UL18、L25、UL26、UL26.5、UL35、UL38基因全长分别为1938bp、891bp、1605bp、1599bp、861bp、312bp、1107bp,分别编码646、297、535、533、287、104、369个氨基酸,与PRV Ka株核苷酸同源性分别为98％、98％、99％、97％、95％、99％、98％,氨基酸同源性分别为97％、98％、99％、97％、95.8％、99％、99％。UL19采用分段克隆,扩增UL19上游368bp,下游600bp的碱基,并酶切PRVEa基因组,回收BamHⅠ第4片段,并进一步酶切构建重组质粒,获得pShuttle-UL19。2.PRV Ea株衣壳蛋白基因在大肠杆菌中的表达及亚细胞定位分析将UL6克隆到原核表达载体pET-28a,获得原核表达质粒pET-28a-UL6,转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导3h后,经12％SDS-PAGE和Western印迹分析在70kDa处出现一条特异性杂交带,表明融合蛋白6×His-UL6具有良好的反应活性。同理,分析融合蛋白6×His-UL18大小为33kDa,GST-UL26.5为56kDa,6×His-UL38为40kDa。进一步将UL6基因亚克隆到真核表达载体pEGFP-C2,获得真核重组表达质粒pEGFP-UL6。同理,构建pEGFP-UL18、pEGFP-UL19、pEGFP-UL25、pEGFP-UL26、pEGFP-UL26.5、pEGFP-UL35和pEGFP-UL38,并将获得的表达质粒分别转染HeLa细胞,在转染后48h通过激光共聚焦显微镜观察荧光,结果显示对照质粒pEGFP-C2转染的细胞在整个细胞中都可见弥散型的绿色荧光分布,且在转染后一直呈弥散型分布;融合蛋白EGFP-UL6定位于细胞质,EGFP-UL18、EGFP-UL26.5以及EGFP-UL38在转染后48h几乎完全定位于细胞核内,而EFGP-UL19、EGFP-UL25、EGFP-UL26、EGFP-UL35转染后一直没有明显的变化,呈弥散型分布。3.哺乳动物双杂交检测PRV Ea株衣壳蛋白基因之间的相互作用pMD-UL18经BamHⅠ和KpnⅠ酶切后,分别插入哺乳动物双杂交表达载体pACT与pBIND的相同酶切位点,获得重组pACT-UL18与pBIND-UL18,同理获得pACT-UL19等14个重组质粒。将pACT分别与pBIND、pBIND-UL6、pBIND-UL18、pBIND-UL19、pBIND-UL25、pBIND-UL26、pBIND-UL26.5、pBIND-UL35、pBIND-UL38:pBIND分别与pACT-UL6、pACT-UL18、pACT-UL19、pACT-UL25、pACT-UL26、pACT-UL26.5、pACT-UL35、pACT-UL38共转染CHO细胞,48h后收集细胞,裂解后采用双荧光报告系统检测,结果显示pACT与pBIND-UL19,pACT与pBIND-UL25,pBIND与pACT-UL26.5存在自激活。根据自激活结果,将构建的哺乳动物双杂交表达质粒两两之间共转染CHO细胞,48h收集细胞,用裂解液充分裂解后双荧光报告系统检测荧光素比值,结果显示UL18与UL38,UL19与UL26.5,UL26.5与UL26之间存在相互作用。4.GST Pull-Down和免疫共沉淀试验验证PRV Ea株衣壳蛋白的相互作用将大肠杆菌表达的UL26.5蛋白与重组杆状病毒rBacUL19感染Sf9细胞48h收集的裂解液,采用GST Pull-Down验证,显示在140kDa可以看见一条特异性条带,是重组杆状病毒rBacUL19的表达产物,说明UL19与UL26.5之间存在相互作用。构建哺乳动物表达质粒pCMV-HA-UL18、pCMV-Myc-UL18、pCMV-HA-UL38以及pCMV-Myc-UL38,将HA-UL18与Myc-UL38,以及HA-UL38与Myc-UL18在脂质体介导下共转染HeLa细胞,48h后裂解细胞,免疫印迹分析UL18与UL38的作用,在HA-UL18与Myc-UL38共转染的细胞裂解液,用HA多抗沉淀的产物,使用Myc单抗可以检测到UL38的表达;而在HA-UL38与Myc-UL18共转染的细胞裂解液,用HA多抗沉淀的产物,使用Myc单抗可以检测到UL18的特异性表达条带,验证UL18与UL38之间存在相互作用。

目录

摘要

ABSTRACT

英文缩略词表(ABBREVIATION)

第1章 文献综述

1.1 病毒的分类

1.1.1 病毒的命名

1.1.2 疱疹病毒和α-疱疹病毒

1.2 PRV的分子生物学

1.2.1 病毒粒子的结构

1.2.2 基因组和基因产物

1.2.3 衣壳蛋白

1.2.4 间质蛋白

1.2.5 囊膜蛋白

1.2.6 在PRV感染过程中宿主转录的改变

1.2.7 在潜伏期的基因表达

1.2.8 DNA复制

1.2.9 核酸代谢

1.2.10 衣壳的形成

1.2.11 环氧化酶和衣壳装配

1.2.12 DNA衣壳化

1.3 PRV作为一种模式病毒

1.4 伪狂犬病对家畜的影响

1.4.1 历史上的发现

1.4.2 在非自然宿主中伪狂犬病感染的致死性

1.4.3 PRV对猪的急性感染

1.4.4 PRV在猪体内的潜伏

1.4.5 修饰的活疫苗

1.4.6 DNA疫苗

1.4.7 PRV的诊断试验

1.4.8 伪狂犬病的世界分布

1.5 哺乳动物双杂交的研究进展

1.5.1 哺乳动物双杂交的原理

1.5.2 杂交新的发展

1.5.3 杂交技术新的应用

1.6 杆状病毒简介

1.6.1 杆状病毒表达系统的研究

1.6.2 杆状病毒作为哺乳动物细胞表达载体的研究

第2章 研究目的和意义

第3章 材料与方法

3.1 实验材料

3.1.1 病毒、细胞和菌株

3.1.2 载体与质粒

3.1.3 工具酶及主要试剂

3.1.4 主要培养基及其配制

3.1.5 缓冲液

3.2 实验方法

3.2.1 PRV的增殖

3.2.2 PRV基因组DNA提取

3.2.3 PRV衣壳基因的PCR扩增

3.2.4 PCR或酶切产物的回收与纯化

3.2.5 线性质粒DNA末端去磷酸化

3.2.6 外源DNA片段与质粒载体的连接反应

3.2.7 大肠杆菌感受态细胞制备

3.2.8 连接产物的转化

3.2.9 质粒的小量制备

3.2.10 质粒的大量制备

3.2.11 质粒DNA的定量

3.2.12 重组质粒(阳性质粒)的鉴定

3.2.13 诱导表达

3.2.14 SDS-PAGE电泳

3.2.15 Western blotting

3.2.16 脂质体介导的共转染

3.2.17 双荧光素酶检测转染基因的相互基因

3.2.18 统计方法

3.2.19 GST Pull-Down

3.2.20 免疫共沉淀

3.2.21 重组杆状病毒的构建流程

第4章 结果与分析

4.1 PRV Ea株衣壳蛋白基因的克隆与序列分析

4.1.1 PRV Ea株UL19基因的克隆与序列分析

4.1.2 PRV Ea株UL6基因的克隆与序列分析

4.1.3 PRV Ea株UL18基因的克隆与序列分析

4.1.4 PRV Ea株UL25基因的克隆与序列分析

4.1.5 PRV Ea株UL26基因的克隆与序列分析

4.1.6 PRV Ea株UL26.5基因的克隆与序列分析

4.1.7 PRV Ea株UL35基因的克隆与序列分析

4.1.8 PRV Ea株UL38基因的克隆与序列分析

4.2 PRV Ea株主要衣壳蛋白在大肠杆菌中的表达与检测

4.2.1 PRV Ea株主要衣壳蛋白原核表达质粒的构建

4.2.2 PRV Ea株衣壳蛋白在大肠杆菌中的表达与检测

4.3 PRV Ea株衣壳蛋白在HeLa细胞中的表达与定位分析

4.3.1 PRV Ea株衣壳蛋白真核表达质粒的构建

4.3.2 PRV Ea株衣壳蛋白真核表达质粒在HeLa细胞中的表达

4.4 哺乳动物双杂交检测PRV Ea株衣壳蛋白的相互作用

4.4.1 哺乳动物双杂交表达质粒的构建

4.4.2 哺乳动物双杂交表达质粒转染细胞后双荧光检测

4.5 GST Pull-Down验证衣壳蛋白UL19与UL26.5之间的相互作用

4.5.1 原核表达质粒pGEX-UL26.5的构建与鉴定

4.5.2 UL26.5基因在大肠杆菌中的表达

4.5.3 转作质粒pFastBac HT-UL19与重组杆状病毒rBacmid-UL19的构建

4.5.4 重组杆状病毒rBacUL19表达产物的SDS-PAGE检测

4.5.5 UL26.5与UL19相互作用的检测

4.6 免疫共沉淀验证衣壳蛋白之间的相互作用

4.6.1 哺乳动物表达质粒的构建

4.6.2 免疫共沉淀

第5章 讨论与结论

5.1 讨论

5.1.1 PRV Ea株主要衣壳蛋白基因的克隆

5.1.2 PRV Ea株衣壳蛋白基因的表达以及在HeLa细胞中的定位

5.1.3 伪狂犬病毒衣壳的装配

5.1.4 哺乳动物双杂交体系的选择

5.1.5 PRV Ea株衣壳蛋白的相互作用

5.2 结论

参考文献

致谢