牛血吸虫病分子ELISA诊断方法的建立和应用

摘要

血吸虫病是世界性分布的人兽共患寄生虫病,是世界卫生组织(WHO)界定的“六大热带病之一”,也是我国的五大寄生虫病之一。我国已报道至少有39种哺乳动物感染血吸虫病,易感家畜和野生动物种类多、数量大,活动范围广,化疗覆盖面小,单靠化疗措施难以控制血吸虫病传播。特别是易感动物耕牛生长周期长,排粪量大,在放牧、使役及流动过程中接触疫水的机会多,从而也增加了防治的难度。血吸虫病的防治,诊断是关键。但目前还没有一种标准的能检测耕牛血吸虫病的试剂盒,因此研制快速、准确、简便的诊断试剂是目前耕牛血防的重要内容之一。血吸虫23 kD表膜蛋白和日本血吸虫信号转导蛋白14-3-3(Sj14-3-3)被认为具有较好的诊断潜力,因此本研究利用原核表达系统高效表达了rLHD-Sj23-GST融合蛋白和rFusion-GST蛋白,并用重组表达的融合蛋白建立了间接ELISA的诊断方法,并利用建立的rLHD-Sj23-GST间接ELISA方法检测了试验牛感染日本血吸虫后0~54w及重感染日本血吸虫后0~28w血清抗体的变化,初步阐明了牛感染及重感染日本血吸虫后体内血清抗体的变化规律。
　　本研究根据已知基因序列设计引物,以提取的日本血吸虫虫体总RNA为模板,利用RT-PCR技术扩增了日本血吸虫LHD-Sj23基因和Sj14-3-3开放读码框基因,首次利用重叠延伸PCR技术将日本血吸虫rLHD-Sj23基因和Sj14-3-3开放读码框基因进行了融合,利用原核表达系统,高效表达了日本血吸虫rLHD-Sj23-GST融合蛋白、rSj14-3-3-GST蛋白和rFusion-GST蛋白,经Western-blot证实重组表达的融合蛋白均具有较好的免疫反应原性。利用纯化的重组蛋白rLHD-Sj23-GST和rFusion-GST作为诊断抗原建立了间接ELISA的诊断方法。所建立的间接ELISA方法与水牛巴贝斯虫和牛泰勒虫均呈阴性反应;间接ELISA能检测到1:320以上稀释血清中的抗日本血吸虫的特异性抗体:诊断试剂的批内与批间重复试验,ELISA变异系数均小于10％;rLHD-Sj23-GST包被的ELISA板在4℃贮存6个月仍有很好的检测效果。
　　以上结果表明,所建立的间接ELISA方法具有较高的特异性、较好的敏感性、稳定性及较长的保质期(rLHD-Sj23-GST)。以从阳性钉螺中逸出的日本血吸虫尾蚴感染及重感染试验牛,复制了牛的血吸虫病。感染后我们从临床症状、粪孵毛蚴试验、感染前后生理生化指标的变化及环卵沉淀试验四个方面对感染日本血吸虫的试验牛进行了监测。在感染后我们观察到了试验牛临床症状的变化,在感染后的49d用粪孵毛蚴法在5头试验牛中均观察到了毛蚴的孵出,感染前后0~14w的生理生化指标呈现出一定的变化,对感染后1~16w的血清进行环卵沉淀试验发现7~11w的血清呈现出阳性反应,以上各项指征均证实试验牛已成功感染了日本血吸虫。以建立的rLHD-Sj23-GST间接ELISA方法检测了试验牛感染日本血吸虫后0~54w体内血清抗体的变化及重感染日本血吸虫后0~28w血清抗体的变化,结果显示:初次感染时,抗体水平在5~8w时转阳,在感染后9w或10w时,抗体水平达最高峰,然后开始逐渐下降,在感染后18~22w转阴,但4＃牛较特殊,在感染后34w抗体水平才转阴;重感染时,在重感染的早期(2w或3w)抗体就能升高到阳性临界值以上,但抗体水平的升高比较缓慢,抗体水平达到顶峰的时间出现在14~18w,这一点与初次感染时明显不同,1＃和3＃牛抗体水平随后逐步下降到阴性临界值以下,而4＃牛的抗体水平的降低则很缓慢,至感染后第28w仍未转阴。
　　本研究中rLHD-Sj23-GST和rFusion-GST间接ELISA诊断方法的建立为快速、准确、简便的耕牛血吸虫病的试剂盒的研制打下了基础,对牛日本血吸虫病的诊断和流行病学调查,进而对牛日本血吸虫病的防治具有重要意义。牛感染和重感染血吸虫后的抗体变化规律的阐明为掌握牛感染日本血吸虫后抗体变化的特点,及时诊断和治疗血吸虫病提供了理论依据。

目录

摘要

Abstract

缩略词表

第一章 文献综述

1 血吸虫病诊断抗原的研究进展

1.1 血吸虫虫体抗原

1.2 组分抗原

1.3 重组抗原

1.4 模拟抗原

1.5 其他抗原

第二章 日本血吸虫LHD-Sj23和Sj14-3-3基因片段以及融合基因的克隆与原核表达

2.1 研究的目的和意义

2.2 材料与方法

2.2.1 试验材料

2.2.2 试验方法

2.3 结果与分析

2.3.1 基因的PCR扩增、克隆及序列测定

2.3.2 重组质粒在E.coli中的表达及存在形式分析

2.3.3 重组蛋白的Western-blot分析

2.3.4 最佳诱导表达条件的优化

2.4 讨论

2.4.1 克隆基因的选择

2.4.2 克隆载体的选择

2.4.3 包涵体的提取和纯化

2.4.4 Sj14-3-3克隆过程中的突变

2.5 小结

第三章 牛血吸虫病rLHD-Sj23-GST及rFusion-GST间接ELISA诊断方法的初步建立

3.1 研究的目的和意义

3.2 材料与方法

3.2.1 试验材料

3.2.2 试验方法

3.3 结果与分析

3.3.1 rLHD-Sj23-GST间接ELISA方法的建立

3.3.2 rFusion-GST间接ELISA方法的建立

3.4 讨论

3.4.1 rLHD-Sj23-GST间接ELISA诊断方法的建立

3.4.2 rFusion-GST间接ELISA诊断方法的建立

3.5 小结

第四章 牛日本血吸虫的人工感染与重感染及血清抗体的变化规律

4.1 目的和意义

4.2 实验材料

4.2.1 试验动物

4.2.2 感染材料

4.2.3 试验仪器

4.2.4 试验药品及试剂

4.2.5 牛感染血吸虫后不同时期的血清

4.2.6 ELISA检测方法中所需的试剂和器材

4.3 试验方法

4.3.1 日本血吸虫尾蚴贴片法感染试验牛

4.3.2 粪孵法查毛蚴

4.3.3 环卵沉淀试验检测血清抗体

4.3.4 感染前后生理生化指标的监测

4.3.5 血清抗体的检测方法

4.4 结果与分析

4.4.1 试验牛感染血吸虫后临床症状的变化

4.4.2 粪孵毛蚴的结果

4.4.3 环卵沉淀试验的结果

4.4.4 生理生化指标的监测

4.4.5 牛初次感染日本血吸虫后血清抗体的变化规律

4.4.6 6#小牛出生后体内母源抗体的变化规律

4.4.7 牛重感染日本血吸虫后血清抗体的变化规律

4.5 讨论

4.5.1 牛日本血吸虫病的人工复制

4.5.2 生理生化指标的变化与日本血吸虫病

4.5.3 粪孵毛蚴法和环卵沉淀试验与日本血吸虫病

4.5.4 试验牛感染与重感染日本血吸虫后抗体变化的差异

4.5.5 小牛母源抗体的变化规律

4.6 小结

4.6.1 牛日本血吸虫的人工感染与重感染

4.6.2 试验牛感染日本血吸虫后血清抗体的变化规律

4.6.3 试验牛重感染日本血吸虫后血清抗体的变化规律

4.6.4 小牛母源抗体的变化规律

结论

参考文献

致谢