栎皮黄酮处理结合茎尖培养脱除砂梨植株中潜隐病毒研究

摘要

苹果褪绿叶斑病毒(Applechloroticleafspotvirus，ACLSV)、苹果茎沟病毒(Applestemgroovingvirus，ASGV)和苹果茎痘病毒(Applestempittingvirus，ASPV)是梨树上重要的潜隐病毒，广泛分布于世界各梨、苹果种植区。在梨树上潜隐病毒通常不产生明显的症状，但影响树势和降低产量。培育和栽培无病毒种苗是降低苹果和梨树病毒危害的最有效途径。化学处理是获得脱病毒种质的重要途径之一。本研究通过改进处理方法，分析了栎皮黄酮处理结合茎尖培养技术脱除梨树上3种主要潜隐病毒的效果，初步探索了砂梨离体植株生根技术，具体研究结果如下： 1.采用RT-PCR技术，对黄花和金水2号两个品种的离体培养植株中ACLSV、ASGV和ASPV3种病毒进行了检测，筛选出带有这3种病毒的离体植株，通过在MS继代培养基上扩繁，获得脱病毒处理材料。 2.采用斑点杂交检测技术分析了25μg/ml水溶液直接浸泡预处理处理金水2号、金水1号和黄花带毒离体植株，对ACLSV、ASGV和ASPV的浓度的影响，结果显示，在处理2d后的离体植株中这3种病毒的杂交检测信号与未处理的带病毒离体植株无明显差别；而处理3d后，这3种病毒的杂交信号均未处理的带毒离体植株的杂交信号明显降低。 3.采用25μg/ml和35μg/ml两种浓度的栎皮黄酮水溶液处理分别预处理3d和4d后，转入含有相应浓度栎皮黄酮的MS培养基中继续处理45d、50d、55d和60d，分别切取2mm、1mm和0.5mm大小的茎尖接种到MS培养基中继代培养一次，采用PAS-ELISA法检测所获再生植株中ACLSV、ASGV和ASPV3种病毒含量的相对变化，结果表明，预处理3d和4d，再在含25μg/ml和35μg/ml栎皮黄酮的MS培养基中处理至第45后，3种病毒检测吸光值均有明显的下降，其中，ACLSV浓度在第55d和第60d下降最明显，以蒸馏水和已二醇单乙醚作相同处理的对照植株中，ELISA检测吸光值无明显差异。采用斑点杂交进一步检测各处理的脱病毒效果，检测的病毒包括ACLSV和ASPV，结果显示，用25μg/ml和35μg/ml栎皮黄酮处理50d和55d后取0.5mm茎尖再培养所获离体植株，无论预处理3d或4d，ACLSV、ASPV杂交信号均有明显的降低。用25μg/ml栎皮黄酮处理60后取0.5mm茎尖及35μg/ml栎皮黄酮预处理4d后在含同浓度的栎皮黄酮培养55d取0.5mm获得的再生植株基本均无杂交信号。从检测结果还可看出，用浓度为35μg/ml栎皮黄酮处理较浓度为25μg/ml栎皮黄酮处理可降低杂交信号，但不能缩短完全脱毒所需时间；延长预处理时间至4d时，可缩短含栎皮黄酮培养基处理时间；所取茎尖大小对栎皮黄酮处理后的脱毒效果影响很明显，当所取茎尖为1mm时，处理60d后的再生植株中这两种病毒仍有较强的杂交信号。 4.设计不同的生根培养基对5-6-45、金水2号和丰水三个品种进行生根试验，结果显示，5-6-45和金水2号在生根培养基1/2MS+2.0mg/LIBA+1.5mg/LNAA2％蔗糖6.5g/L琼脂粉pH为5.8上的生根率达到90％以上，且根系发达。丰水在1/2MS(大量)+0.5IBA+0.5NAA2％蔗糖0.7％琼脂pH为5.8的生根培养基中，可以生根，但生根率低且根系不发达，对所获5-6-45和金水2号的生根离体植株进行了成功的移栽。

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论文说明：缩略词表

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第一章文献综述：梨树上潜隐病毒的研究进展

1.1砂梨上三种潜隐病毒的分布及危害

1.2砂梨上三种潜隐病毒的理化特性

1.3砂梨潜隐病毒的检测方法

1.3.1生物学方法

1.3.2血清学方法

1.3.3分子生物学方法

1.4梨树潜隐病毒的脱除

1.4.1温度处理方法

1.4.2茎尖培养法

1.4.3热处理结合茎尖培养法

1.4.4化学处理方法防治

1.5研究的目的和意义

第二章栎皮黄酮处理结合茎尖培养脱除砂梨病毒的效果

2.1试验材料

2.1.1待处理砂梨样品

2.1.2试剂

2.1.3质粒和菌株

2.1.4 PCR引物

2.2研究方法

2.2.1 PAS-ELISA检测

2.2.2试管捕捉RT-PCR(TC-RT-PCR)

2.2.3斑点杂交检测

2.2.4栎皮黄酮处理与茎尖培养结合脱病毒

2.3结果与分析

2.3.1待脱病毒处理砂梨离体植株病毒检测结果

2.3.2栎皮黄酮浸泡对离体植株茎尖中病毒浓度影响

2.3.3栎皮黄酮对砂梨离体植株生长的影响

2.3.4栎皮黄酮处理结合茎尖培养对金水2号离体植株病毒浓度影响

2.3.5栎皮黄酮处理结合茎尖培养对黄花离体植株病毒浓度影响

2.4小结与讨论

第三章不同砂梨品种生根技术研究

3.1试验材料

3.2生根培养基

3.2.1以1/2MS培养基为基本生根培养基设计不同激素浓度的生根培养基

3.2.2设计丰水梨的生根培养基

3.3试验方法

3.3.1不同梨品种的生根试验

3.3.2丰水梨的生根试验

3.4结果与分析

3.4.1不同品种的生根率及生根状况

3.4.2丰水梨的生根率及生根状况

3.4.3移栽

3.5结论与讨论

附录 试验常用溶液配方

参考文献

致谢