鱼类神经坏死病病毒衣壳蛋白基因分析及其真核表达

摘要

鱼类病毒性神经坏死病(virusnervousnecrosis，VNN)的病原为鱼类神经坏死病毒，它属于诺达病毒科(Nodaviridae)中的β-诺达病毒属。自80年代报道以来，目前该病毒引起的疾病在除非洲以外的世界其它地方迅速蔓延开来，给各国海水养殖业造成了巨大的损失。神经坏死病毒基因组包括两条正义的、非聚腺苷酸化的RNA单链(RNA1和RNA2)。RNA1的大小约为3.0kb-3.2kb，主要编码非结构A蛋白，是一种依赖RNA的RNA聚合酶；RNA2的大小约为1.3kb-1.4kb，其开放阅读框编码一个病毒衣壳蛋白。近年来我国沿海大规模网箱养殖的石斑鱼，由于受神经坏死病毒的感染，给育苗生产带来极大的损失。 从本室分离到的6株NNV提取病毒基因组RNA。根据已报道的RNA2片断全序列设计引物，用RT-PCR方法特异性扩增出6株病毒的衣壳蛋白基因片段，分别连接到PMD18-T载体中，并进行序列测定和分析。结果发现，6个NNV分离株的RNA2片断核苷酸序列的同源性在97.3％以上；推导的氨基酸序列同源性在79.6％-99.1％之间。根据RNA2片断核苷酸序列绘制的分子进化树表明，6个NNV分离株在进化树同一分枝上，属于RGNNV基因型，与已报道的点带石斑鱼神经坏死病病毒(ECNNV)、巨石斑鱼神经坏死病病毒(ETNNV)及玛拉巴石斑鱼神经坏死病病毒(MGNNV)亲缘关系较近。试验结果表明，我国沿海养殖场发生的鱼类病毒性神经坏死病均由同一来源的病毒引起的，该基因型的鱼类神经坏死病毒在我国沿海养殖的石斑鱼中传播流行。 利用RT-PCR技术获得病毒性神经坏死病毒0603株的衣壳蛋白基因，将其插入到杆状病毒Bac-To-Bac表达系统的pFastBacI质粒中，构建了pFastBac-cp质粒，转化DH10Bac大肠杆菌后获得重组穿梭载体Bacmid-cp，脂质体介导转染Sf9细胞产生有感染力的重组杆状病毒AcNPV-cp。SDS-PAGE，ELISA和Western-blotting分析可见大小约为37kD的特异性蛋白带，其可以与病毒性神经坏死病毒阳性血清反应，表明AcNPV-cp在Sf9细胞中成功地表达了病毒性神经坏死病毒的衣壳蛋白。电镜观察发现，cp蛋白可自行装配成病毒样粒子，其大小形态类似全病毒，并呈晶格状排列在细胞质中。

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论文说明：缩略语表

声明

第一章文献综述

1.1VNN的国内外研究现状

1.1.1 VNN的发现及危害

1.1.2 VNN的病理学变化

1.1.3 NNV的种类和地理分布

1.1.4易感水生动物

1.1.5传播途径

1.1.6 NNV的理化特性

1.1.7 NNV的分子生物学

1.1.8检测NNV感染的诊断方法

1.1.9 VNN的免疫预防研究

1.2杆状病毒表达系统

1.2.1杆状病毒的生物学特性

1.2.2杆状病毒转染载体

1.2.3杆状病毒表达体系的应用

1.3研究目的和意义

第二章6株鱼类神经坏死病病毒(NNV)cp基因的分子特征和遗传发生分析

2.1材料与方法

2.1.1病毒、载体和细胞

2.1.2主要试剂与溶液配制

2.1.3质粒抽提溶液配制

2.1.4引物

2.1.5病毒RNA的提取

2.1.6 NNV cp基因的RT-PCR扩增

2.1.7 RT-PCR扩增产物的回收

2.1.8连接反应

2.1.9大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备

2.1.10大肠杆菌DH5α感受态细胞的转化

2.1.11 pMD18-cp质粒小量提取

2.1.12酶切鉴定

2.1.13序列测定和分析

2.2结果与分析

2.2.1RT-PCR扩增结果

2.2.2 pMD18-cp克隆载体的酶切鉴定

2.2.3 cp基因的核苷酸序列及与推导的氨基酸序列比较

2.2.4 NNV衣壳蛋白cp基因限制性内切酶位点分析

2.2.5 6株NNV分离株cp基因序列与国内外毒株RNA2序列比较分析

2.2.6NNV分离株推导的氨基酸序列分析

2.3讨论

第三章鱼类神经坏死病病毒衣壳蛋白在昆虫细胞中的表达及其特性研究

3.1材料与方法

3.1.1质粒、载体和细胞

3.1.2主要试剂与溶液配制

3.1.3穿梭载体Bacmid的提取液

3.1.4空斑试验试剂配制

3.1.5 SDS-PAGE、Western-blotting的相关试剂

3.1.6 ELISA的相关试剂

3.1.7主要仪器

3.1.8构建重组杆状病毒操作流程示意图

3.1.9大肠杆菌DH10Bac感受态细胞的制备

3.1.10供体质粒pFastBac-cp的构建

3.1.11重组穿梭载体Bacmid-cp的构建

3.1.12重组Bacmid-cp的提取

3.1.13 Sf9的细胞活化与冻存

3.1.14脂质体介导转染Sf9细胞

3.1.15重组杆状病毒AcNPV-cp的感染

3.1.16空斑实验

3.1.17表达产物的SDS-聚丙烯酰胺电泳

3.1.18表达产物的Western-blotting检测

3.1.19体外表达cp蛋白的粗纯化

3.1.20间接ELISA检测AcNPV-cp表达的外源蛋白

3.1.21 NNV cp蛋白负染与电镜观察

3.1.22感染AcNPV-cp的Sf9细胞切片

3.2结果和分析

3.2.1供体质粒pFastBac-cp的构建

3.2.2穿梭载体Bacmid-cp的构建

3.2.3重组杆状病毒AcNPV-cp的获得

3.2.4重组病毒滴度测定

3.2.5体外表达蛋白SDS-PAGE分析

3.2.6体外表达蛋白的Western blotting鉴定

3.2.7酶联免疫吸附试验(ELISA)

3.2.8 NNV cp蛋白负染与电镜观察

3.2.9感染AcNPV-cp的Sf9细胞切片

3.3讨论

参考文献

硕士期间研究成果

致谢