胸膜肺炎放线杆菌和猪瘟病毒的基因组测序与比较基因组学研究

摘要

猪传染性胸膜肺炎(PorcineContagiousPleuropneumonia，PCP)是由胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacilluspleuropneumoniae，APP)引起的一种高度接触传染的呼吸道疾病。猪瘟(Swinefever,SF)，欧洲人称为古典猪瘟(Classicalswinefever，CSF)，是由猪瘟病毒(Classicalswinefevervirus，CSFV)引起的一种高度接触性和致死性传染病。这两种重要的病原微生物所引起的疾病已经给全世界的养猪业造成了巨大的经济损失。 随着高通量测序技术的发展，越来越多的基因组序列被测序完成，对基因组序列的比较分析为探索微生物的遗传变异提供了一个崭新的机会。我们利用生物信息学的分析方法和策略，对以上2种病原微生物的基因组序列进行了深入地比较与分析，描述了基因组序列结构与病原的致病能力/代谢机制之间的关系。主要的研究内容包括： 1.APP的基因组测序与分析目前，APP根据表面脂多糖和荚膜多糖的不同划分成至少15个血清型，不同血清型菌株的毒力、抗原性和地域分布不尽相同。APP血清型的这些特点为发展安全有效的疫苗和简易的诊断方法带来了困难。 APP代谢和致病的分子机制一直以来都是兽医界和诊断医学界研究的热点。但是APP基因组信息的缺乏已成为制约该细菌研究技术发展的瓶颈。因此，解析我国流行的优势血清3型APP的全基因组序列，不仅为国际APP基因组计划提供了“参考序列”，而且为该病防治技术的研究提供了理论依据和研究材料。 在本研究中，我们对一株在中国流行的优势血清3型APPJL03株进行了基因组测序，并且首次对APP进行了全面的功能注释和分析比较。完成测序的JL03基因组由一个长度为2,242,062bp的染色体组成，一共预测出2097个蛋白质的编码序列，6个核糖体rRNA操纵子和63个tRNA基因(GenBank登陆号：CP000687)。另外，加拿大测序完成的APP血清5b型L20株的长度约为2.27Mbp，含有2012个CDS：而部分测序的APP血清1型4074株序列包含140个连接群(contig)，长约2.07Mbp，含有2132个CDS。在三个已测序的APP菌株中，JL03株为低毒力株，L20和4074株均为强毒株。 通过APP三个菌株间以及APP与巴斯德菌科其他物种的比较基因组学的研究，详细描述了APP的代谢机制和致病性/毒力的特征。确认了APP代谢通路上的一系列基因，证实APP可以通过发酵和呼吸(有氧呼吸和无氧呼吸)两种方式产生能量(ATP)，并且为阐明这一复杂的代谢网络提供了一个全面的遗传基础。在JL03基因组中，鉴定出一些特征性的基因组岛：同化硫还原基因串；F1p鞭毛合成基因串，参与细菌黏附作用；荚膜多糖合成基因串，参与细菌荚膜多糖的合成；脂多糖O抗原基因串，参与细菌O抗原的合成。同时，我们发现在L20株中存在一个37.7kb的基因组岛，其上编码了8个噬菌体相关基因，该岛未在JL03株中发现。这些基因组岛的发现为进一步研究APP血清多样性的机制提供了基础。 另外，我们描述了与细菌毒力相关的一整套基因，JL03株中的某些基因发生了遗传上的丢失或者不同类型的突变。以上分析证实了以往对该病原毒力决定簇的认识，为解释不同血清型菌株之间毒力的差异提供了理论依据。 总之，APP基因组序列结构的解析和编码蛋白质功能的初步分析不仅证实了该菌部分生理生化的表型特征，并且为探索这个重要病原菌的毒力和代谢的特征提供了新的研究设想。 2.CSFV的基因组测序与分析CSFV属于黄病毒科瘟病毒属，只有单一的血清型，是一种单正链的RNA病毒。在本研究中，我们对一株分离自中国河南的CSFVSWH/CA/2004株进行了基因组测序和分析比较。SWH/CA/2004基因组cDNA的序列长度为12296nt(GenBank登陆号：DQ127910)，5'NTR长度为373nt，3'NTR的长度为226nt以及一个开放读码框，编码一个3898个氨基酸的聚蛋白前体。对SWH/CA/2004株与其它已报道的CSFV株进行基因组的序列比对和进化分析后发现：不同株基因组的核苷酸的相似性在92.4％-97.9％之间，氨基酸的相似性在96.1％-98.4％之间。SWH/CA/2004与中国强毒株cF114/CA/2001株的遗传距离最接近，为0.013；而与中等毒力的GXWZ02/CA/2003株的遗传距离较远，为0.170。 我们全面利用和分析了现有的不同地区来源的猪瘟病毒全长基因组的序列信息，揭示出CSFV的系统发生关系，为研究猪瘟病毒的遗传变异和分子流行病学提供了参考材料和研究基础。 3.黄病毒科RNA聚合酶表达抑制的研究黄病毒科的依赖于RNA的RNA聚合酶(RNA-dependentRNApolymerase，RdRp)参与组成病毒的复制酶复合体，在病毒的复制循环中发挥重要的作用。在本研究中，针对三种病毒的RNA聚合酶基因高度保守的MotifV区域设计了相应的小干扰RNA分子(smallinterferingRNA，siRNA)，用来研究siRNA分子在调控RNA聚合酶表达过程中的作用。 我们通过荧光显微镜观察、流式细胞检测、Westernblot检测和半定量荧光RT-PCR等方法验证了表达抑制的效果。由于筛选到的CSFV的siRNA能够十分有效地抑制RdRp-GFP融合蛋白在PK-15细胞中的表达，因此有望成为预防和免疫猪瘟病毒感染猪的候选疫苗。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词表

声明

第1章文献综述

1.1微生物基因组学的研究背景

1.2微生物比较基因组学的研究进展

1.2.1基因组学研究方法的发展

1.2.2微生物比较基因组学

1.3基因组学在细菌学中的应用

1.3.1细菌病原的分子检测和鉴定

1.3.2细菌的基因分型

1.3.3杀菌剂抗性基因的检出

1.3.4宿主与病原相互关系的探索

1.3.5单克隆抗体的研制

1.3.6疫苗的设计

1.4胸膜肺炎放线杆菌(APP)的生物学特性

1.4.1 APP的分类地位和代谢特性

1.4.2 APP毒力因子的研究

1.5猪瘟病毒(CSFV)的研究进展

1.5.1 CSFV基因组的非编码区

1.5.2 CSFV基因组的编码区

1.5.3 CSFV的分子流行病学及遗传多样性

第2章胸膜肺炎放线杆菌JL03株全基因组测序与注释及比较基因组学分析

2.1研究目的和意义

2.2材料与方法

2.2.1菌株

2.2.2质粒载体

2.2.3培养基

2.2.4主要生化试剂和溶液的配制

2.2.5细菌基因组的提取

2.2.6基因组DNA随机文库的构建

2.2.7基因组文库的大规模测序

2.2.8基因组数据的处理和拼接

2.2.9基因组的注释

2.2.10比较基因组学分析

2.3结果与分析

2.3.1胸膜肺炎放线杆菌JL03株的基因组测序

2.3.2胸膜肺炎放线杆菌JL03基因组的注释与比较分析

2.3.3 APP基因组的进化分析

2.3.4基因组序列结构的比较

2.3.5基因组的代谢和调控分析

2.3.6毒力因子的分析

2.4讨论

2.4.1基因组测序的策略问题

2.4.2 APP的铁吸收系统

第3章猪瘟病毒强毒株SWH/CA/2004株全基因组测序和分析

3.1研究目的和意义

3.2材料与方法

3.2.1病毒、细胞、质粒及细菌

3.2.2生化试剂及试剂盒

3.2.3培养基与抗生素

3.2.4引物设计与合成

3.2.5 CSFV RNA的提取

3.2.6 RT-PCR扩增与检测

3.2.7 CSFV强毒株全基因序列测定与分析

3.3结果与分析

3.3.1 CSFV SWH/CA/2004株全基因组的克隆及测序

3.3.2 SWH/CA/2004株基因组的基本结构

3.3.3 CSFV株的分子进化关系分析

3.3.4 CSFV基因组各基因的相似性分析

3.3.5 CSFV基因型的划分

3.3.6 CSFV 5'-NTR，Ern5，E2和3'-NTR的突变

3.3.7 SWH/CA/2004聚蛋白二级结构的预测

3.4讨论

第4章siRNA对黄病毒科RNA聚合酶表达抑制的研究

4.1研究目的和意义

4.2材料与方法

4.2.1细胞、菌株和质粒

4.2.2酶与试剂

4.2.3抽提质粒相关溶液

4.2.4 SDS-PAGE和Western blot相关溶液

4.2.5引物设计与合成

4.2.6 siRNA的设计与合成

4.2.7感受态细胞的制备、质粒的转化、质粒制备与纯化

4.2.8 siRNA表达载体的构建

4.2.9 RNA聚合酶基因与报告基因(EGFP)融合表达载体的构建

4.2.10 siRNA表达载体与各融合报告质粒共转染

4.2.11转染后的荧光检测

4.2.12流式细胞检测

4.3.13 Western blot检测

4.3.14实时定量RT-PCR检测

4.3结果

4.3.1 siRNA表达载体的构建

4.3.2 RdRp基因与报告基因(EGFP)的融合表达

4.3.3 siRNA表达载体与目的基因重组质粒共转染后的荧光检测

4.3.4流式细胞检测

4.3.5 Western blot检测

4.3.6 siRNA在mRNA水平抑制的检测

4.4讨论

第5章结论

参考文献

致谢

附表1.JL03菌株基因组的预测基因功能分类列表

附表2.个人简介

研究生阶段的发表论文