猪四个肌肉相关基因分离、SNPs检测及遗传效应分析

摘要

分子标记辅助选择与传统育种方法相结合是目前猪遗传改良工程所采取的主要方法之一，作为分子标记辅助选择的基础，寻找与重要经济性状相关的主效基因和分子标记是十分关键的。随着人、鼠、猪分子遗传图谱、QTL定位以及功能基因组研究的深入，本文利用已报道的与猪重要生产性状相关的QTL，在与之同源的人、鼠等染色体区域内选择与经济性状可能相关的候选基因也是一种切实可行的筛选新基因的方法。基于此，本研究的四个基因分为两部分，第一部分：MRLC2基因和PYGM基因，是由谢红涛博士以猪背最长肌为材料，利用抑制消减杂交技术构建了梅山猪及其杂交F1代梅大猪背最长肌间的正反向消减cDNA文库，进行了差异表达基因筛选得到的两个基因。第二部分：MEF2D和SRPK3基因，应用比较基因组学、生物信息学等方法分离得到的基因。并取得了以下结果： 1.肌球蛋白轻链调控蛋白基因(MyosinLightChainkinase,MRLC2)。 肌球蛋白轻链调控蛋白(MRLC2)基因是一种丝氨酸/苏氨酸激酶的底物，被有丝分裂因子活化蛋白激酶(MAPK)激活，其磷酸化在肌肉收缩中起关键作用，在非肌肉细胞的肌动蛋白(actin)纤维化中也起重要作用。扩增内含子1742bp的序列，通过序列比较发现有18个碱基突变和8个碱基的缺失，在178位点发现c/T突变。用Hin61内切酶对170头2003年大白×梅山F2代群体进行酶切分型，发现该位点与屠宰率(P<0.01)呈极显著相关；大理石纹评分BF(P<0.05)呈显著相关。 2.糖原磷酸化酶基因(GlycogenPhosphorylase,Muscleform，PYGM)。 糖原合成与分解代谢的调节点是糖原合成酶和磷酸化酶，其活性决定不同途径的代谢速率，从而影响糖原代谢的方向。糖原合成酶和磷酸化酶的快速调节有共价修饰和变构调节两种方式。获得该基因得第7内含子，第8内含子，第9内含子。序列大小分别为：828bp、480bp和351bp。并在第7内含子附近的外显子上发现一个G/T突变，在第八内含子上发现一个A/G突变，分别用TaaI内切酶、MvaI内切酶分型。在外显子上的突变用TaaI内切酶对173头2004年大白×梅山F2代群体进行酶切分型，发现与瘦肉率呈显著相关(P<0.05)。对第8个内含子用的MvaI内切酶对163头2003年大白×梅山F2代群体进行酶切分型，发现该位点与总皮重(P<0.01)、总骨重(P<0.01)和骨率(P<0.01)呈极显著相关，与皮率(P<0.05)呈显著相关。 3.肌肉生长因子基因(MyooyteEnhancerFactor2,MEF2D)。 生肌增强因子MEF2是结合在各种诱导型的生长因子和肌肉特异启动子的保守元件上，具有能与DNA结合的特异序列而被人们认识的，它是肌肉特异基因激活的重要转录因子。获得了该基因的5102bp的DNA序列，在靠进5'端发现一个G/A突变，用Bsp120I内切酶对172头2004年大白×梅山F2代群体进行酶切分型，发现该位点与大理石纹评分呈显著相关LD(P<0.05)，BF(P<0.05)。 4.猪丝氨酸/精氨酸特异蛋白激酶(Serine/arginine-RichProteinspecificKinase3，SRPK3)基因。 作为肌细胞增强因子(MEF2)调控的靶基因--SRPK3，被MEF2蛋白直接调控的特异表达；在猪的生产中，SRPK3基因的功能还没有被发现。采用电子克隆和RACE技术，克隆该基因cDNA全长序列，cDNA全长2011bp，ORF为1701bp，编码566个氨基酸，5'UTR长度为32bp，3'UTR长度为243bp。 5.猪丝氨酸/精氨酸特异蛋白激酶(Serine/arginine-RichProteinspecificKinase3，SRPK3)基因的生物信息学分析。 利用ClustalX、ORFFinder、SignalP2.0、ANTHEPORT、PSORTII、TMprep等软件对猪SRPK3基因结构、所编码的蛋白质结构、功能、系统进化等特征进行了预测和分析，并构建了分子系统进化树。 6.利用半定量RT-PCR技术对猪丝氨酸/精氨酸特异蛋白激酶(Serine/arginine-RichProteinspecificKinase3，SRPK3)基因进行了不同组织(肌肉、脂肪、心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胃、小肠、子宫、卵巢和睾丸)间的表达分析，在肌肉和心脏中特异表达。

目录

文摘

英文文摘

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声明

第一章文献综述

1.1比较基因组学的研究进展

1.2电子克隆技术在分离新基因中的应用

1.2.1 EST的概念和技术原理

1.2.2应用EST分离新基因

1.3 SNP研究进展及在猪遗传育种中的应用

1.3.1 SNP的概念及特点

1.3.2 SNP的检测分析方法

1.3.3 SNP在猪遗传育种中的应用

1.4猪骨骼肌生长发育相关基因的研究进展

1.5四个与肌肉相关的基因的研究进展

1.5.1肌球蛋白轻链调控蛋白基因(Myosin light chain kinase,MRLC2)

1.5.2糖原磷酸化酶基因PYGM(Glycogen phosphorylase,muscle form,PYGM)

1.5.3候选基因——生肌增强因子MEF2D

1.5.4候选基因——丝氨酸/精氨酸特异蛋白激酶3(SRPK3)

第二章研究目的和意义

第三章材料与方法

3.1试验材料

3.1.1试验样品和性状测定

3.1.2主要仪器和设备

3.1.3主要药品及试剂

3.1.4缓冲液和常用试剂的配制

3.2.总RNA的提取及利用RT-PCR方法扩增CDNA

3.2.1总RNA的提取

3.2.2 RNA的反转录(Reverse transcription，RT)

3.2.3 RACE CDNA的合成

3.3 PCR产物的回收、纯化和克隆测序

3.4 DNA序列的生物信息学分析及相应的软件

3.5猪四个相关基因的研究方法

3.5.1猪MRLC2基因

3.5.2猪PYGM基因组序列的克隆、测序、SNP的检测

3.5.3猪MEF2D肌肉增强因子基因组序列的克隆、测序、SNP的分析

3.5.4猪SRPK3基因的cDNA全长序列和基因组的克隆、测序和组织表达谱的研究

第四章实验结果

4.1总RNA提取

4.2猪MRLC2基因

4.2.1猪MRLC2基因组序列的克隆及序列分析

4.2.2猪MRLC2基因的SNP分析

4.3猪PYGM基因

4.3.1猪PYGM基因组序列的克隆及序列分析

4.3.2猪PYGM基因的SNP分析

4.4猪MEF2D基因

4.4.1猪MEF2D基因组序列的克隆及序列分析

4.4.2猪MEF2D基因的SNP分析

4.5猪SRPK3基因

4.5.1猪SRPK3基因的cDNA序列的克隆

4.5.2猪SRPK3基因的cDNA序列分析及推导的氨基酸序列

4.5.3猪SRPK3基因组序列克隆

4.5.4猪SRPK3基因组序列分析

4.5.5利用半定量RT-PCR对猪SRPK3基因进行组织表达谱分析

第五章讨论

5.1候选基因的筛选

5.2关于SNPs的检测

5.3关于基因的遗传效应分析

5.4关于表达谱研究的分析

第六章小结

6.1本研究获得的结果及创新点

6.2本研究的不足之处及下一步值得研究的工作

参考文献

致谢