猪流产嗜性衣原体抗体ELISA检测与基因免疫研究

摘要

流产嗜性衣原体（Chlamydophila abortus，CAB）是引起猪、牛、羊等多种动物流产、死胎、弱胎等慢性接触性疾病的一种重要病原体，孕妇也可感染而发生流产。建立准确、快速的诊断方法和研制安全、高效的疫苗是预防和控制本病的重要措施。本研究应用PCR技术获得CAB主要外膜蛋白（MOMP）全长基因和四种不同片段大小多型性外膜蛋白90（POMP90）的编码基因，构建重组表达质粒，进行原核表达获得重组蛋白，探讨了其在猪CAB感染血清学检测中的应用价值，建立了猪CAB间接ELISA抗体检测方法；并构建了momp基因真核表达质粒，及细胞因子IL-2、IFN-γ编码基因与momp基因真核共表达质粒，比较了pcDNA3.1和PCI-neo两种真核表达载体基因免疫效应的差异，探索了细胞因子和中药提取成分枸杞多糖对基因免疫的佐剂效应。
　　 1．本研究根据已知基因序列设计引物，以流产嗜性衣原体CP/12株的总DNA为模板，PCR扩增了momp全长基因和四种不同片段大小的pomp90基因，与pMD18-T载体连接后进行测序鉴定。将目的基因与原核表达载体pGEX-KG进行连接，构建重组表达质粒，在大肠杆菌E．coli BL21中实现了高效表达，表达产物经Western-blot检测分析，结果表明具有较强的免疫原性。进而以纯化后的五种重组蛋白作为包被抗原，建立了间接ELISA抗体检测方法，并对临床血清进行了检测。结果表明，重组MOMP蛋白不适合于建立间接ELISA抗体检测方法，而四种重组POMP蛋白建立的间接ELISA抗体检测方法均具有灵敏度高、特异性好、准确等优点，且克服了传统间接血凝试验低灵敏度、判断主观性强等缺点。
　　 2．将momp基因分别克隆到真核表达载体pcDNA3.1和PCI-neo，构建真核表达质粒pcDNA3.1-MOMP和PCI-MOMP，并进行了小鼠免疫试验，比较不同真核表达载体构建基因疫苗免疫效应的差异。结果表明，PCI-MOMP可诱导更高的体液免疫效应和微弱的细胞免疫，但未观察到更有效的免疫保护。
　　 3．将获得的猪IL-2和IFN-γ编码基因插入真核表达质粒PCI-MOMP中构建真核共表达质粒，并通过小鼠接种试验评价了两种细胞因子通过真核表达质粒混合免疫和基因共表达对基因免疫的佐剂效应。结果表明，两种细胞因子既不能增强体液免疫效应，也未观察到增强的细胞免疫效应和有效的免疫保护。
　　 4．将中药提取成分枸杞多糖与真核表达质粒PCI-MOMP同时对小鼠进行免疫，评价了枸杞多糖对基因免疫的佐剂效应。结果表明1，枸杞多糖可显著增强体液免疫效应，但未观察到更高的细胞免疫效应和免疫保护效果。
　　 本论文建立了猪流产嗜性衣原体间接ELISA抗体检测方法，探索了momp基因疫苗的免疫效应，以及不同真核表达载体对基因免疫效应的影响，细胞因子和枸杞多糖对momp基因疫苗的免疫佐剂效应，并取得了一定效果，为进一步开展猪流产嗜性衣原体病的免疫预防和诊断研究奠定了基础。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略语表

声明

第一章 前言

1.1流产嗜性衣原体及其危害

1.1.1衣原体及其危害

1.1.2流产嗜性衣原体对猪的危害

1.2流产嗜性衣原体病原学研究

1.2.1流产嗜性衣原体分类地位

1.2.2流产嗜性衣原体基因组研究

1.2.3流产嗜性衣原体主要基因与蛋白质研究

1.3流产嗜性衣原体的免疫应答

1.4流产嗜性衣原体病的预防和治疗

1.5流产嗜性衣原体病诊断方法研究

1.5.1病原学方法

1.5.2血清学方法

1.5.3分子生物学方法

1.6流产嗜性衣原体疫苗研究进展

1.6.1全病原疫苗

1.6.2基因工程疫苗

1.6.3基因疫苗

1.7 本研究的目的和意义

第二章 猪流产嗜性衣原体ELISA抗体检测方法的建立

2.1材料与方法

2.1.1试验材料

2.1.2试验方法

2.2结果与分析

2.2.1目的基因的克隆

2.2.2重组原核表达质粒的构建

2.2.3重组质粒pKG-MOMP的表达及免疫原性检测

2.2.4重组质粒pKG-POMP的表达及免疫原性检测

2.2.5重组POMP ELISA方法的建立

2.3讨论

2.3.1原核表达载体的选择

2.3.2间接ELISA抗体检测方法的建立

2.4 小结

第三章 猪流产嗜性衣原体基因免疫及其佐剂研究

3.1材料与方法

3.1.1试验材料

3.1.2试验方法

3.1.3数据统计分析

3.2结果与分析

3.2.1真核表达质粒的构建

3.2.2真核表达质粒在真核细胞中的表达

3.2.3真核表达质粒的免疫效应研究

3.2.4细胞因子真核表达质粒和共表达质粒的构建

3.2.5细胞因子对基因免疫的影响研究

3.2.6枸杞多糖对基因免疫的影响研究

3.3讨论

3.3.1真核表达载体的选择

3.3.2不同真核表达载体对基因免疫效果的影响

3.3.3细胞因子对基因免疫效应的影响

3.3.4枸杞多糖免疫佐剂效应的评价

3.4小结

结 论

参考文献

附录

致谢