水稻T-DNA插入突变体的构建及同源染色体配对基因PAIR3的分离与鉴定

摘要

水稻是重要的粮食作物，也是禾谷类作物功能基因组研究的模式植物。突变体是研究基因功能最直接、最有效的途径之一，因此构建水稻大型突变体库是在全基因组水平上大规模、全面、系统的研究基因功能的重要技术平台。农杆菌介导的T-DNA转化因其在水稻基因组中相对随机的分布规律，高效的转化体系，稳定的后代遗传及简单的遗传背景，被广泛的用于水稻突变体库的构建。本研究通过农杆菌介导的T-DNA随机插入构建突变体库，在正常栽培条件下种植T1代分离群体，目测筛选有明显突变表型的家系并进行突变表型与T-DNA纯合插入共分离的检测，并针对共分离家系，分离克隆相应基因并进行其功能分析。主要研究结果如下：
　　 1．创建独立T-DNA转化单株30，579株。
　　 2．筛选9，193个突变家系，观察到有突变表型的家系1，417个，突变率为15.4％，得到3个共分离家系：03211UG73，03211UL95，03211UF78。突变性状分别为：白化苗，半矮，完全不育。对03211UF78进行详细的突变表型分析并分离克隆相应基因PAIR3。
　　 3.03Z11UF78家系分离出的不育突变体命名为pair3-1。相对于分离出的野生型单株，其突变体在营养生长阶段及花序，花的发育都没有任何差别；但在开花时，突变体的花药不外露，至成熟时，突变体完全不育。KI-I2溶液染色显示突变体的花粉粒几乎全不着色，表明突变体雄性不育。野生型花药做父本，pair3-1做母本，杂交不结实，表明突变体雌性也不育。
　　 4.03Z11UF78家系的T1代及T2代共分离检测显示完全不育的性状与T-DNA纯合插入完全共分离。
　　 5．从本室突变体库中得到等位突变体05211HE71，命名为pair3-2，突变性状也是完全不育，T1代共分离检测也是完全共分离。
　　 6．转双链RNAi载体的转化单株育性明显降低，35％（21/60）单株为完全不育。部分单株取RNA做半定量PCR分析显示：转基因单株的育性与PAIR3基因的表达相对应。
　　 7． RT-PCR及RACE确定PAIR3的基因序列。PAIR3基因在TIGR中编号为LOC_Os10g26560，基因全长为6，930bp（转录起始至终止），全长cDNA为2，963bp，由11个外显子及10个内含子组成，编码一个包含844个氨基酸的蛋白。BLASTN分析显示PAIR3基因是一个新基因，在已完成基因组测序的物种中没有找到同源基因或蛋白。基因结构预测只有一个coiled-coil结构域。
　　 8．花药半薄切片显示：相对于野生型花药的发育，pair3花粉囊壁的发育没有受到影响；花粉母细胞的发育及其随后的小孢子也没有明显变化；但在花粉有丝分裂时期至成熟花粉时期，花粉粒皱褶、干瘪，没有活力。
　　 9．胚囊石蜡切片显示：相对于野生型胚囊的发育，pair3胚囊在功能大孢子形成时期出现异常，大孢子减数分裂后靠近合点端的大孢子不是变大形成功能大孢子，而是随着另三个靠近珠孔端的大孢子相继降解而降解。最终突变体胚珠中没有胚囊的结构，只见一些珠心组织降解的痕迹。
　　 10．花粉压片染色观察突变体的减数分裂过程。结果显示：pair3在终变期可见24条染色单体及后期Ⅰ染色体随机分离。我们推测PAIR3基因通过影响水稻同源染色体的配对，造成性母细胞减数分裂中染色体的随机分离，从而导致pair3雌雄性都不育。
　　 11．半定量PCR分析显示：PAIR3基因在稻穗中有表达，在茎、叶、叶鞘等营养器官中不表达或很低水平的表达，这与突变体在营养阶段没有表型而只造成雌雄都不育相对应；PAIR3基因在突变体（pair3-1和pair3-2）中都不表达，表明两个等位突变体都是功能缺失（loss-of-function）的突变体；PAIR3基因在不同长度的穗子中都有表达，但是表达趋势是先上升再下降，在穗长为4.5cm至11cm时表达最强，而这时正是性母细胞减数分裂时期。
　　 12．原位杂交结果显示：PAIR3基因在花药早期的花粉囊壁细胞及孢原细胞中有微弱表达，随后在小孢子母细胞、四分体、刚游离出的小孢子中高表达，在小孢子中表达慢慢降低至液泡化大孢子期完全不表达，之后又特异的在降解中的绒毡层中表达；PAIR3基因在胚囊早期的孢原细胞及珠被原基中有微弱表达，随后在整个胚珠、珠柄、子房内壁中表达，但主要是在大孢子母细胞减数分裂时或刚完成时表达最强。因此PAIR3基因主要是在减数分裂时期的性母细胞中高表达，表明．PAIR3在减数分裂中起作用。PAIR3表达模式与突变表型相对应。
　　 13．目前水稻中已报道的影响减数分裂的5个基因（PAIR1、PAIR2、MEL1、OsDMC1、OsRAD2-4）在pair3-1及野生型中的表达无差异，表明PAIR3可能不参与以上基因的表达调控。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩写名词表

声明

1. 文献综述

1.1植物功能基因组学

1.2植物功能基因组学的研究方法及技术

1.2.1全基因组的表达分析

1.2.2系统的基因破坏

1.2.3新一代测序

1.3植物花药发育的过程及突变体分析

1.3.1植物花药发育的过程

1.3.2植物花药发育过程的分期

1.3.3植物花药发育的突变体分析

1.4植物胚囊发育的过程及突变体分析

1.4.1植物胚囊发育的过程

1.4.2植物胚囊发育过程的分期

1.4.3植物胚囊发育的突变体分析

1.4植物减数分裂的过程及研究进展

1.4.1植物减数分裂的过程

1.4.2植物减数分裂的研究进展

2.本研究的目的和意义

3.材料与方法

3.1实验材料

3.1.1植物材料

3.1.2质粒载体和细菌菌株

3.2实验方法

3.2.1大型突变体库的构建

3.2.2突变体的种植及筛选

3.2.3突变家系植株的DNA抽提及PCR阳性检测

3.2.4突变家系植株的T-DNA插入侧翼序列分离

3.2.5突变家系的突变表型与T-DNA插入的共分离分析

3.2.6水稻各组织总RNA抽提，检测及RT-PCR

3.2.7各种遗传转化载体的构建

3.2.8 PAIR3基因全长序列的确定

3.2.9 pair3突变体的细胞学观察

3.2.10 PAIR3基因的表达分析

3.2.11水稻已知减数分裂相关基因在突变体中的表达分析

3.2.12酵母双杂交实验

3.2.13亚细胞定位分析

4.结果与分析

4.1大型突变体库的构建

4.2 2003年突变体的种植及突变体鉴定

4.3 2004年突变体的种植及突变体鉴定

4.4 LOC_Os10g40650的功能分析

4.4.1 T1，T2代的遗传稳定性及共分离分析

4.4.2白化苗叶绿体超微结构的观察

4.4.3互补实验及RNAi抑制实验

4.5 LOC_Os06g13640的功能分析

4.5.1 T1，T2代的遗传稳定性及共分离分析

4.5.2互补实验及RNAi抑制实验

4.5.3 03Z11UL95家系突变表型的鉴定

4.6 PAIR3的功能分析

4.6.1 pair3-1突变体的获得

4.6.2 03Z11UF78家系T1，T2代的遗传稳定性及共分离分析

4.6.3等位突变体pair3-2的鉴定

4.6.4转双链RNAi植株育性明显降低

4.6.5 PAIR3基因序列的确定

4.6.6.PAIR3是一个编码coiled-coil结构域的新基因

4.6.7 pair3突变表型的细胞学观察

4.6.8 PAIR3基因的表达分析

4.6.9水稻已知减数分裂相关基因的在突变体中的表达分析

4.6.10酵母双杂交实验

4.6.11亚细胞定位分析

5.讨论

5.1水稻突变体库的现状及利用

5.2 正向遗传学鉴定水稻减数分裂基因

5.3 PAIR3在雌雄配子体发育中的作用

5.4 PAIR3在减数分裂中的作用

5.5 PAIR3与PAIR1，PAIR2的比较

5.6 PAIR3在减数分裂中可能的作用机理

参考文献

附录

致谢