超量表达谷氨酰胺合成酶、硝酸根转运蛋白和铵离子转运蛋白家族1基因对水稻氮代谢的功能研究

摘要

目前，随着社会工业化进程的愈演愈烈，我国的耕地面积越来越少，为了满足人们的粮食需求，通过施用化学肥料特别是氮肥来提高粮食产量已经成为我国农业生产的主要手段之一。然而，随着大量氮肥的投入，提高农作物经济产量的效益却越来越低，而且伴随着水资源的大面积污染。水稻是我国以及全球最重要的粮食作物之一，随着近年来分子生物学技术的飞速发展，对水稻氮代谢相关基因进行研究并培育对氮高效吸收和利用的转基因水稻新品种将为我国水稻生产甚至是整个农业发展起着十分重要的意义。本研究以获得对氮高效吸收和利用的转基因水稻新品种为目标，通过超量表达水稻氮代谢相关基因，包括：谷氨酰胺合成酶基因（GS）、硝酸根转运蛋白基因（NR7）和铵离子转运蛋白基因（AMT），对转基因植株进行了详细系统的分子生物学和生理生化研究。主要结果如下：
　　 1．使用生物信息学方法在NCBI数据库搜索获得水稻氮代谢相关基因GS1；1、GS1；2、GS1；3、GS2、glnA、NRT2、AMT1；1、AMT1；2和AMT1；3的序列信息；并通过cDNA文库和PCR扩增，分离克隆到上述基因完整的编码序列。以载体pCAMBIA1301S为基础，构建了9个超量表达载体，以35S启动子启动基因GS1；1、GS1；2、GS1；3、GS2、glnA、NRT2、AMT1；1、AMT1；2和AMT1；3在水稻中进行组成型大量表达。通过Southern和Northern杂交，对转基因植株进行转基因拷贝数和表达量的检测，来获得超量表达的单拷贝转基因植株。
　　 2．超量表达GS1；1、GS1；2和glnA的转基因植株，其生长表型没有明显差异，生物产量也没有显著提高；但是生理生化指标的测定结果表明，转基因植株与野生型植株相比表现为更高的代谢水平，包括：GS活性、水溶性蛋白含量、游离NO3-和NH4+、游离氨基酸含量、总氮和总氨基酸含量；其单株经济产量和籽粒氨基酸含量却比野生型植株显著降低（P<0.05）。非生物胁迫试验结果表明，超量表达GS1；2的转基因植株对Basta表现为明显的抗性，而且对高浓度NaCl、冷和干旱胁迫条件均表现为更加敏感；超量表达glnA的转基因植株对高浓度NaCl胁迫条件也表现为敏感，对其它胁迫条件均没有明显的生长差异；而超量表达GS1；1的转基因植株对所试验的胁迫条件均没有生长差异。
　　 3．超量表达GS2的转基因植株，在后代出现黄化分离的生长表型，黄化植株生长受到抑制，叶片黄化、分蘖少、生物产量低、结实少，但是仍然能够完成整个生育期的生长。生理生化指标的测定结果表明，黄化转基因植株的GS活性、水溶性蛋白和游离NH4+含量显著降低（P<0.05），单个游离氨基酸产生明显的变化，但是游离氨基酸总含量却维持在稳定水平，与野生型植株相比没有显著差异。超量表达GS2的转基因植株，其黄化分离的现象不受到基因型的遗传，而是由于GS2基因的共抑制引起的；叶片黄化只出现在2叶期之后，在成熟植株中只有顶端幼嫩叶片黄化，而底部老叶片保持绿色；此黄化现象能够被体外添加Gln培养而恢复。
　　 4．超量表达GS1；3、NRT2和AMT1；2的转基因植株，其生长表型和生物产量与野生型植株相比均没有显著差异，但是在超量表达．NRT的转基因家系中发现一个T-DNA插入突变体，表现为根卷曲的生长表型，而地上部没有明显变化，生物产量与野生型植株相比也没有明显差异。超量表达AMT1；3的转基因植株与野生型植株相比，其生长瘦弱，株高和鲜重均降低；对其游离NH4+含量的测定结果表明，地上部和地下部的游离NH4+含量均下降；通过Northern杂交显示，转基因植株的GS基因表达量没有显著变化。
　　 由此可见，超量表达GS1；1、GS1；2和glnA的转基因水稻植株，虽然没有表现为生长更具优势，生物产量提高的生长表型，但是在一定程度上确实提高了对氮的吸收和利用，表现为相对高的代谢水平。当然，还有很大一部分工作，特别是超量表达GS1；3、NRT2、AMT1；1、AMT1；2和AMT1；3的转基因植株后代还需要进一步研究和测定，来证实其对氮代谢水平的影响。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩写名词表

声明

前言

1文献综述

1.1植物体内氮的营养特征

1.1.1植物体内氮的含量和分布

1.1.2植物体内氮的生理功能

1.1.3氮对植物光合作用的影响

1.2植物对氮的吸收和利用

1.2.1植物对氮的吸收

1.2.2植物对氮的利用

1.3植物谷氨酰胺合成酶(GS)的研究概况

1.3.1谷氨酰胺合成酶与其相关基因

1.3.2谷氨酰胺合成酶的生化性质

1.3.3谷氨酰胺合成酶的反应途径与功能

1.3.4谷氨酰胺合成酶的基因表达调节

1.3.5谷氨酰胺合成酶介导的碳氮平衡

1.3.6谷氨酰胺合成酶转基因植物的研究现状

1.4植物基因功能研究的策略和方法

1.4.1基因功能丧失或减少

1.4.2基因功能增加

1.5农杆菌介导的遗传转化系统和抗性标记基因的使用

1.6本研究的目的和意义

2材料与方法

2.1实验所用的水稻材料和菌株

2.2遗传转化的基因片段

2.3载体的构建和遗传转化

2.3.1骨架载体的构建

2.3.2超量表达载体的构建

2.3.3 RNAi抑制表达载体的构建

2.3.4基因启动子融合GFP载体的构建

2.3.5基因的遗传转化

2.4 DNA的提取、转基因植株的阳性检测及转基因拷贝数的检测

2.4.1 DNA的提取

2.4.2转基因植株的阳性检测

2.4.3转基因拷贝数的Southern检测

2.5 RNA的抽提、反转录及表达量的检测

2.5.1 RNA的抽提

2.5.2转基因表达量的RT-PCR和Northern检测

2.6转基因植株的种植和性状考察

2.6.1水培试验和性状考察

2.6.2田间试验和性状考察

2.7转基因植株生理生化指标的测定

2.7.1谷氨酰胺合成酶活性的测定

2.7.2水溶性蛋白含量的测定

2.7.3游离NO3-含量的测定

2.7.4游离NH4+含量的测定

2.7.5游离氨基酸含量的测定

2.7.6总氮含量的测定

2.7.7总氨基酸含量／籽粒氨基酸含量的测定

2.7.8叶片叶绿素含量的测定

2.8转基因植株的非生物胁迫试验和性状考察

2.8.1 Basta胁迫试验

2.8.2高浓度NaCl胁迫试验

2.8.3冷胁迫试验

2.8.4干旱胁迫试验

2.8.5 ABA敏感性试验

2.8.6体外添加Gln培养试验

3结果与分析

3.1超量表达GS1；1、GS1；2和glnA转基因植株的获得与功能分析

3.1.1转基因植株的获得与鉴定

3.1.2转基因植株的生理生化指标的分析

3.1.3转基因植株的非生物胁迫试验

3.2超量表达GS2转基因植株的获得与功能分析

3.2.1转基因植株的获得与鉴定

3.2.2转基因植株的表型与生物产量的分析

3.2.3转基因黄化植株的生理生化指标的分析

3.2.4转基因黄化植叶绿素含量的测定分析

3.2.5转基因黄化植株叶绿素合成途径及光呼吸途径相关基因表达分析

3.2.6转基因黄化植株体外添加Gln的试验

3.3超量表达GS1；3、NRT2、.AMT1；1、AMT1；2和AMT1；3转基因植株的获得与功能分析

3.3.1转基因植株的获得与鉴定

3.3.2转基因植株生长表型和生物产量的分析

3.3.3超量表达AMT1；3植株NH4+含量的测定分析

3.3.4超量表达AMT1；3植株相关基因表达分析

3.4 RNAi抑制表达以及启动子融合GFP蛋白的转基因植株的获得与分析

3.4.1 RNAi抑制表达的转基因植株的获得与鉴定

3.4.2启动子融合GFP蛋白的转基因植株的获得与鉴定

3.4.3基因表达模式的分析

4讨论

4.1关于GS1;1、GS1；2和glnA基因功能的探讨

4.1.1转基因植株的生长表型

4.1.2转基因植株的代谢水平

4.1.3转基因植株对非生物胁迫条件的反应

4.2关于GS2基因功能的探讨

4.2.1转基因植株的生长表型

4.2.2转基因植株的代谢水平

4.3关于GS1；3、NRT2、AMT1；1、AMT1；2和AMT1；3基因功能的探讨

4.4关于氮高效利用的转基因水稻新品种培育方法的探讨

4.4.1氮高效利用的转基因水稻新品种的应用前景

4.4.2超量表达GS1；2转基因植株在育种上的应用前景

4.4.3氮高效利用的转基因水稻培育新方法探讨

4.5关于后续工作的设想

参考文献

致谢

附录