炭疽杆菌eag基因的功能研究

摘要

炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)简称炭疽杆菌,是能形成芽孢的革兰氏阳性杆菌,是人畜共患炭疽病的病原体。它可感染动物和人而引起皮肤炭疽、肺炭疽和肠炭疽等。炭疽杆菌可被用作生物战剂以及用来制造生物恐怖。相关研究表明,细菌S-层普遍具有保护细胞、连接细胞外酶类、分子筛和细胞黏附等作用,在病原体中还可抵抗宿主的免疫攻击,很可能是一种毒力因子。炭疽杆菌除已知的质粒上的毒力基因外,染色体上的一些基因也很可能与毒力相关,如由炭疽杆菌染色体基因编码的S-层蛋白,它被认为可能是重要的疫苗和药物的靶标。炭疽杆菌的S-层蛋白主要包括胞外抗原1(extracellularantigen1,EA1)和表面排列蛋白(surface array protein,Sap)。
　　本课题以炭疽杆菌疫苗株A16R为实验菌株,通过同源重组方法获得了编码EA1蛋白的基因eag缺失突变株,并在核酸水平和蛋白水平上进行了验证。然后通过生长曲线测定及糖代谢实验、比较蛋白质组学、细胞模型与动物模型实验,比较了突变株与野生株之间的差别,研究了eag基因的功能,以期为炭疽杆菌疫苗的进一步研究提供借鉴。
　　主要研究结果如下：1、突变株的构建本研究以穿梭质粒pKSV7为载体,构建了同源重组载体pKSV7usd,采用电转化法将其导入炭疽杆菌疫苗株A16R中,通过同源重组筛选方法,获得了A16R△eag∶∶spc突变株。
　　2、突变株和野生株生长曲线及糖代谢实验突变株与野生株在对数期、稳定期和衰亡期3个时期的生长情况几乎没有区别。糖代谢结果显示野生株与突变株均可利用核糖、果糖、葡萄糖、N-乙酰-葡糖胺、七叶灵、纤维二糖、麦芽糖、蔗糖、海藻糖、糖原10种碳水化合物。并分别培养48 h后观察,发现突变株和野生株对糖的利用能力没有差别,说明eag基因可能与糖代谢相关性不大。
　　3、突变株和野生株的毒力评价实验突变株和野生株的芽孢分别对CHO细胞作用后的平均OD490值为0.457和0.407,t检验表明突变株毒力弱于野生株。二者芽孢共同与巨噬细胞J774A.1相互作用后的毒力竞争指数为0.52,即突变株的毒力大约是野生株的50％。突变株和野生株的芽孢对BALB/c小鼠的攻毒实验,结果小鼠的平均存活时间分别为31.37h和21.03h;二者的繁殖体对BALB/c小鼠的攻毒实验,结果小鼠平均存活时间分别为27.12h和20.68h。均说明突变株攻击后小鼠存活时间较长,突变株毒力弱于野生株。二者芽孢对小鼠肺侵袭实验的竞争指数为0.55,也说明突变株的毒力减弱一半。以上细胞与动物实验均表明突变株的毒力弱于野生株,且大约是野生株毒力的50％。推测野生株中EA1可能具有保护功能,免受宿主细胞杀菌因子的作用。
　　4、突变株和野生株的蛋白质组学研究制备对数期(8h)、稳定期(23h)、衰亡期(35h)三个时相的全菌体蛋白样品,构建不同pH梯度的双向电泳图谱,通过比较分析获得95个差异点,并鉴定到代表24种蛋白的54个蛋白点,其中有8个在炭疽杆菌全谱的相关文献中未见报道,30个为缺失的目的蛋白EA1。通过对所鉴定到蛋白质的细胞定位分析,表明它们主要集中定位于细胞质中。功能分析表明,这些蛋白主要与能量合成及基因转换、氨基酸转运和代谢、无机离子转运和代谢有关,且表达量在突变株中均呈下调趋势,说明EA1蛋白缺失后影响了这些代谢的正常运行。通过对EA1蛋白对应多个蛋白点的分析,表明EA1蛋白存在翻译后修饰(磷酸化)的特性。对鉴定到的蛋白分析,未发现S-层另外一个主要组成蛋白Sap的表达变化,因此EA1蛋白缺失后未影响Sap蛋白的表达。
　　通过质谱分析,鉴定到两种假想的S-层蛋白BA3338(对应2个蛋白点)、BA1127,这些蛋白的功能未知。当目的蛋白缺失后,它们的表达量均增加,推测它们可能补偿eag基因的一些功能,以维持炭疽杆菌的生存。BA3338对应两个蛋白点现象也是由于发生了磷酸化的原因。进一步通过结构分析发现这EA1蛋白和这两种假想的S-层蛋白在N端均具有起着锚定在细胞表面作用的SLH(S-layer-homology domain)结构域,但是3个蛋白的C端结晶结构域不同。蛋白质组学比较,未发现与炭疽杆菌毒力相关的蛋白,说明突变株毒力的减弱是由于目的蛋白EA1所引起的,因此推断eag基因可能是染色体上的一个毒力因子。为炭疽杆菌疫苗的进一步研究提供了线索。

目录

摘要

ABSTRACT

缩略语表

第一章 文献综述

1 炭疽杆菌致病机理

2 炭疽杆菌的S-层蛋白

2.1 S-层蛋白的结构

2.2 S-层蛋白的功能

2.3 S-层蛋白的调控

3 炭疽杆菌疫苗的研究

3.1 国外炭疽杆菌疫苗的研究

3.2 国内炭疽杆菌疫苗的研究

4 炭疽杆菌比较蛋白质组研究

5 炭疽杆菌实验模型

5.1 细胞模型

5.2 动物模型

6 本研究的目的与意义

第二章 炭疽杆菌A16R△eag∷spc的构建

1 材料和方法

1.1 材料

1.2 方法

2 结果与分析

2.1 重组质粒的构建

2.2 炭疽杆菌电击转化体系的建立

2.3 重组质粒电转炭疽杆菌A16R感受态验证

2.4 A16R△eag∷spc突变株的验证

3 讨论

3.1 质粒的选择

3.2 炭疽杆菌转化体系的建立

3.3 炭疽杆菌中质粒和染色体提取

3.4 突变株筛选方法的改进

第三章 突变株和野生株的生长曲线及糖代谢比较

1 材料和方法

1.1 材料

1.2 方法

2 结果与分析

2.1 生长曲线的测定

2.2 糖代谢

3 讨论

第四章 突变株与野生株毒力评价

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

2 结果与分析

2.1 芽孢计数及石碳酸复红-美蓝染色

2.2 突变株与野生株芽孢对CHO细胞的损伤作用

2.3 突变株与野生株芽孢与巨噬细胞J774A.1的作用

2.4 突变株与野生株芽孢、繁殖体分别对BALB/c小鼠的攻毒实验

2.5 突变株与野生株芽孢对BALB/c竞争性侵袭小鼠肺实验

3 讨论

3.1 关于芽孢萌发

3.2 关于细胞实验

3.3 关于动物实验

第五章 突变株与野生株比较蛋白质组学研究

1 材料和方法

1.1 材料

1.2 方法

2 结果与分析

2.1 8h全菌体蛋白样品的pH4.0-7.0预测图

2.2 不同时相不同pH梯度全菌体蛋白样品的双向电泳图谱

2.3 蛋白质鉴定

2.4 各时相差异蛋白质的表达特点

2.5 所鉴定蛋白质的细胞定位情况

2.6 所鉴定蛋白质的功能分类情况

2.7 各功能相关蛋白质在突变株和野生株中的差异表达

2.8 EA1蛋白的表达

2.9 假想的S-层蛋白的表达变化

3 讨论

3.1 各功能相关蛋白质在野生株和突变株中的差异表达分析

3.2 EA1蛋白的表达及翻译后修饰

3.3 假想的S-层蛋白的表达分析

第六章 结论

参考文献

致谢

附录1 各试剂盒操作步骤

附录2 实验中所用仪器设备

附录3 实验中所用试剂

附录4 双向电泳图

附录5 所鉴定到的蛋白的相关信息

附录6 发表文章及个人荣誉