蜂王浆活性蛋白的分离、纯化、生物活性及结构初步表征

摘要

本文对高活性蜂王浆蛋白的提取、分离、纯化及其抗氧化和免疫活性进行了系列研究。结果如下:以鲜蜂王浆蛋白质为研究对象,通过蛋白质的分离分级及测定各级分蛋白含量和抗氧化性,确定了清蛋白为目标蛋白级分。并采用单因素和正交试验优化清蛋白提取工艺。结果表明,提取液pH值、料液比对清蛋白提取率有显著影响,而温度、提取时间、NaCl浓度影响不显著,最佳提取工艺为pH8.0,温度0℃,料液比1∶20,时间2h,此条件下清蛋白的相对提取率达到87.21％。在最佳提取条件下制备清蛋白提取物,应用化学发光法研究其对羟基自由基、超氧阴离子自由基、过氧化氢的清除作用及对DNA损伤的保护作用。结果显示,清蛋白在体外具有良好的抗氧化活性,其IC50分别为3.81mg/mL、5.16mg/mL、7.43μg/mL和4.34mg/mL。清蛋白提取物对DPPH·的IC50为0.315mg/mL。清蛋白对小鼠肝脏脂质体过氧化也具有一定抑制作用。同时研究了清蛋白提取物对正常小鼠的免疫调节活性,结果表明,清蛋白提取物能显著调节小鼠细胞免疫、体液免疫、非特异性免疫和NK细胞活性。
　　应用Sephadex G-100凝胶过滤层析、DEAE-52离子交换层析及两种方法结合分离纯化清蛋白,SDS-PAGE鉴定洗脱峰的纯度。清蛋白先过Sephadex G-100凝胶过滤层析,再过DEAE-52离子交换层析的方法能纯化出具有活性的单一蛋白组分RJA-57(royal jelly albumin-57kDa,RJA-57)。经SDS-PAGE、Native-PAGE、SephadexG-100、紫外吸收光谱鉴定其纯度,均表明所制备的RJA-57是单一蛋白组分。并对其体外抗氧化性做了初步研究,结果表明,RJA-57能有效清除DPPH·,保护DNA损伤,其IC50为0.139mg/mL和2.47mg/mL。对小鼠肝脂质过氧化也有抑制作用。RJA-57氨基酸组成分析表明,其含有人体必需的8种氨基酸,其中色氨酸和含硫氨基酸丰富,是一种优质的蛋白质。RJA-57的FT-IR红外光谱显示蛋白质的特征红外吸收峰,且初步判断其β-折叠结构所占比例远大于α-螺旋结构。圆二色谱分析了RJA-57分别在25℃、70℃条件下的二级结构组成,结果显示,两种温度下RJA-57均含有较多的β-折叠和无规则卷曲,且温度升高,α-螺旋、β-折叠比例降低,无规则卷曲比例增大。并利用内源荧光和荧光淬灭研究了RJA-57分子tryptophan(tryptophan,Trp)残基溶液构象行为,结果显示,部分Trp残基暴露于蛋白质分子表面,也有部分包埋于疏水区内。

目录

摘要

ABSTRACT

第一章 前言

1 蜂王浆化学组成

2 蜂王浆生物活性

2.1 抗衰老活性

2.2 免疫调节活性

2.3 抗肿瘤、抗菌作用

2.4 促进细胞增殖作用

2.5 其他生物活性

3 蜂王浆氨基酸、肽、蛋白类成分研究进展

3.1 蜂王浆氨基酸研究进展

3.2 蜂王浆肽类研究进展

3.3 蜂王浆蛋白质研究进展

4 研究目的、意义及研究内容

4.1 研究目的和意义

4.2 主要研究内容

第二章 蜂王浆清蛋白提取工艺研究

1 实验材料与方法

1.1 实验材料

1.2 实验试剂和仪器

1.3 实验方法

2 结果与分析

2.1 蜂王浆主成分分析

2.2 蜂王浆蛋白各级分的制备及目标级分的确定

2.3 清蛋白等电点的测定

2.4 清蛋白的SDS-PAGE分析

2.5 清蛋白提取条件的优化

3 小结

第三章 清蛋白生物活性研究

1 材料与方法

1.1 清蛋白的抗氧化性

1.2 清蛋白对正常小鼠免疫调节活性

2 结果与分析

2.1 蜂王浆清蛋白提取物的抗氧化性

2.2 清蛋白对正常小鼠的免疫调节作用

3 讨论

4 小结

第四章 RJA-57的分离纯化

1 材料

1.1 实验材料的制备

1.2 主要试剂

1.3 仪器和设备

2 方法

2.1 Sephadex G-75凝胶过滤层析

2.2 Sephadex G-100凝胶过滤层析

2.3 DEAE-52离子交换层析

2.4 Sephadex G-100凝胶与DEAE-52离子交换柱相结合的方法

2.5 SDS-PAGE

2.6 Native-PAGE

2.7 目标蛋白组分纯度的鉴定

2.8 目标蛋白质等电点的测定

3 结果与分析

3.1 Sephadex G-75分离清蛋白

3.2 Sephadex G-100分离清蛋白

3.3 DEAE-52分离清蛋白

3.4 SDS-PAGE

3.5 Sephadex G-100凝胶与DEAE-52离子交换柱相结合的方法

3.6 RJA-57纯度鉴定

3.7 RJA-57等电点的测定

4 小结

第五章 RJA-57结构初步表征及抗氧化活性研究

1 主要试剂

2 主要仪器和设备

3 实验方法

3.1 RJA-57氨基酸组成分析

3.2 RJA-57表面疏水性的测定

3.3 RJA-57游离巯基和总巯基测定

3.4 RJA-57的荧光光谱

3.5 RJA-57红外光谱

3.6 RJA-57圆二色谱分析

3.7 目标蛋白抗氧化活性初步研究

4 结果与分析

4.1 RJA-57氨基酸组成

4.2 表面疏水性及巯基、二硫键分析

4.3 RJA-57的荧光光谱

4.4 RJA-57的FT-IR光谱

4.5 RJA-57的圆二色性光谱

4.6 RJA-57抗氧化活性初步研究

5 讨论与小结

第六章 结论

1 目标蛋白的确定及提取工艺优化

2 清蛋白生物活性研究

3 RJA-57的分离纯化

4 RJA-57结构初步表征及抗氧化活性研究

主要参考文献

致谢