萝卜-芥蓝杂种F代创制及其诱发的表观遗传变异

摘要

远缘杂交是植物遗传研究和遗传改良的重要技术之一，杂交可以综合亲本种的适应性或创造出新的适应性，丰富基因库，拓宽生境，进而促进基因组进化和新种形成。植物远缘杂交及此后的多倍体化过程中除了产生遗传学变异外，还能够产生的大量表观遗传变异。
　　 本研究以萝卜（Raphanus sativus L．）为母本，以芥蓝（Brassica alboglabra Bailey）为父本，采用人工去雄授粉的方法进行杂交，然后通过进行胚抢救（Embryo Rescue）得到F1代植株。利用RAPD（随机扩增的多态性DNA）技术对杂交苗进行了鉴定。通过对100条10碱基RAPD引物进行筛选，筛选出11条引物可用于杂种鉴定。在F1代中不仅扩出了亲本特异带，还扩出了其特有带。鉴定结果表明，F1代材料在遗传基础上是来源于萝卜和芥蓝，为杂交所得。
　　 通过Southern杂交分析45S rDNA，5S rDNA在亲本和世代之间的表观遗传变异。结果表明45S rDNA在传代的过程中有甲基化减少再增多的趋势，说明45S rDNA在传代的过程中可能存在着活跃-沉默-活跃的变化，在杂种F1代形成及传代过程中45S rDNA基因甲基化状态发生了变化，而5S rDNA在亲本及子代中甲基化变化不大，说明5S rDNA的表观遗传稳定性较大，受到远缘杂交的冲击较小。
　　 本研究利用MSAP（甲基化敏感扩增多态性）技术，对杂种形成及传代过程中的甲基化变化进行了研究。对亲本及杂种的甲基化模式研究表明，亲本和杂种之间的甲基化模式存在一定的差异，83.27％甲基化模式稳定遗传给了下一代，与亲本相比杂种中存在一小部分的去甲基化和超甲基化的现象。通过比较超甲基化和去甲基化所占的比例可知，在杂种形成过程中去甲基化占主要地位。无论是发生甲基化还是去甲基化可能都是对杂种优势有利的。
　　 对亲本及F1代，F4代，F10代甲基化模式研究表明，71.21％甲基化模式在传代过程中没有发生太多变异还是稳定的遗传给了后代。此外，在传代的过程中，有些CCGG位点发了去甲基化现象，有些发生了超甲基化现象，还有些在传代过程中甲基化先升高后降低或者先降低后升高。说明在杂种稳定的过程中有些基因甲基化状态发生了变化。这可能是两套遗传系统相互稳定，相互协调的结果。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略语

声明

1前言

1.1植物的远缘杂交

1.1.1远缘杂交的意义

1.1.2杂种胚不育现象

1.1.3组织培养技术在远缘杂交中的应用

1.2远缘杂交种的鉴定

1.2.1形态学鉴定

1.2.2细胞学鉴定

1.2.3同工酶谱鉴定

1.2.4分子标记鉴定

1.3远缘杂交与表观遗传变异

1.3.1表观遗传的含义

1.3.2基因沉默

1.3.3 DNA甲基化

1.3.4核仁显性

1.4 DNA甲基化的研究方法

1.4.1基于重亚硫酸处理的DNA甲基化的分析技术

1.4.2不依赖重亚硫酸盐处理的DNA甲基化的分析技术

1.5 rDNA概述

1.6本课题的研究目的和意义

2材料和方法

2.1材料及试剂

2.1.1实验材料

2.1.2主要试剂

2.1.3 PCR引物

2.2实验方法

2.2.1田间杂交

2.2.2胚抢救

2.2.3基因组DNA的提取

2.2.4 RAPD鉴定

2.2.5含45S rDNA质粒的转化筛选提取及5S rDNA的扩增

2.2.6酶切基因组DNA

2.2.7探针标记

2.2.8 Southern杂交

2.2.9 MSAP

3结果与分析

3.1杂交苗F1代的获得

3.2 RAPD鉴定

3.3 5S rDNA扩增

3.4 Southern blot检测rDNA甲基化

3.5整体基因组甲基化的检测

3.5.1亲本和F1代甲基化的检测

3.5.2子代甲基化的检测

4讨论

4.1 F1代的RAPD鉴定

4.2传代过程中的rDNA表观遗传变异

4.3远缘杂交带来的植物基因组DNA甲基化变异

参考文献

致谢