鸭疫里氏杆菌免疫诊断方法及在感染鸭肝脏差异表达基因的研究

摘要

鸭疫里氏杆菌（Riemerella anantipestifer，RA）病是由鸭疫里氏杆菌引起的雏鸭的一种急性、接触性败血性传染病，是严重危害我国养鸭业的重要传染病之一。鸭疫里氏杆菌血清型复杂，各血清型之间缺乏有效的交叉免疫保护，这给使用全菌灭活疫苗或弱毒疫苗进行该病的免疫防治带来了诸多困难。临床分离菌株的鉴定和血清定型及鸭群鸭疫里氏杆菌抗体的监测，对了解鸭疫里氏杆菌的流行情况和制定有效的免疫计划以及评价疫苗免疫效果具有重要意义。鸭疫里氏杆菌在入侵宿主后，迅速在感染位点定居、繁殖，经血液扩散到全身各组织器官，引起全身多发性浆膜炎并发展为败血症。而目前对鸭疫里氏杆菌如何在宿主体内生存、繁殖和逃避免疫系统监视并致病的分子机制知之甚少。本研究针对我国流行的血清1型鸭疫里氏杆菌的42kD外膜蛋白OmpA进行了克隆、表达和免疫原性研究，探索外膜蛋白OmpA的免疫保护作用及其作为包被抗原建立用于鸭疫里氏杆菌分子流行病学调查的ELISA诊断方法；在此基础上，利用选择性捕获转录序列技术对鸭疫里氏杆菌在感染鸭肝脏基因差异表达进行了研究，为进一步开展了鸭疫里氏杆菌致病分子机理的研究，阐明雏鸭腹腔广泛性浆液渗出的分子机制奠定基础。本研究取得的结果如下：
　　 1．鸭疫里氏杆菌平板染色诊断抗原的制备和应用
　　 用本实验室鉴定、保存的血清1型鸭疫里氏杆菌云梦分离株（RA-YM）制备了RA平板染色诊断抗原，该抗原与鸭流感、鸭瘟、鸭肝炎、鸭大肠杆菌和鸭沙门氏菌的等5种病原的阳性血清无交叉反应；染色抗原平板凝集试验与琼脂免疫扩散试验（AGID）对RA疫苗免疫鸭的抗体检出率结果表明，在疫苗免疫后12天，平板凝集法即可检测到RA抗体，检出率为30％，AGID在免疫后31天才能检测到抗体，检出率为10％，而平板凝集法的检出率为80％，平板凝集法抗体检出率明显高于AGID，且染色抗原平板凝集试验比AGID的灵敏度高3个滴度；不同批次的平板染色诊断抗原检测的阳性率基本相当，在凝集程度上有较小的差异，表明不同批次平板染色诊断抗原具有良好的重复性。以RA-YM和纯化的鸭IgG为免疫原免疫鸭和兔，制备了鸭抗1型RA和兔抗鸭IgG的高免血清，平板凝集试验检测鸭抗RA-YM高免血清的效价为1：32，兔抗鸭IgG高免血清的琼扩效价为1：64。以制备的鸭抗血清1型RA血清对分离自湖北省不同地区的23株鸭疫里氏杆菌进行血清型鉴定，结果均为血清1型，表明我省目前流行的RA主要是血清1型。将制备的兔抗鸭IgG高免血清纯化后，经辣根过氧化物酶（HRP）标记，制备出特异性强、免疫学活性高的兔抗鸭IgG-HRP，工作浓度为1：4000，为下一步建立一种用于RA流行病调查的间接ELISA诊断方法奠定了基础。
　　 2．鸭疫里氏杆菌OmpA基因的克隆、表达及重组OmpA蛋白免疫保护性试验研究
　　 根据RA15型CVL110/89株OmpA基因序列（GeneBank登录号：AF104936）合成特异性引物，PCR扩增了RA-YM株OmpA基因，克隆到pMD18-T，获得重组质粒pT-OmpA并进行了测序；将OmpA克隆到pGEX-KG，构建了重组原核表达质粒pGEX-OmpA，转化E．coli BL21后经IPTG诱导获得高效表达，经SDS-PAGE分析，表达的重组蛋白的分子量为68kD，表达产物主要以包涵体形式存在，Western-blot证实表达产物具有良好的生物学活性。将重组表达的OmpA蛋白以0.5mg、1.0mg、1.5mg三个免疫剂量分别与弗氏完全佐剂乳化后免疫7日龄樱桃谷肉鸭，17日龄以同样剂量加强免疫，二免后8天攻毒（3×106CFU/只），在攻毒24h后蛋白免疫组和未免疫空白组均发病，动物试验结果表明重组表达的OmpA不能起到保护作用。
　　 3．鸭疫里氏杆菌间接OmpA-ELISA检测方法的建立及初步应用
　　 用大肠杆菌表达的重组蛋白OmpA建立了RA抗体OmpA-ELISA检测方法，方阵滴定确定了抗原最佳包被浓度为0.81μg/mL，血清最佳稀释倍数为1：160。通过检测84份鸭疫里氏杆菌病阴性血清，确定该方法的阴阳性临界值为0.22。用该方法检测鸭流感，鸭瘟，鸭肝炎，鸭大肠杆菌和鸭沙门氏菌的标准阳性血清OD450值均小于临界值0.22，表明该方法与其它病原抗体无交叉反应，特异性强。重复性试验表明OmpA-ELISA检测方法的批内重复和批间重复的变异系数均小于10％。用建立的OmpA-ELISA检测方法和平板凝集分别对213份送检血清进行检测，结果表明OmpA-ELISA检测方法的敏感性为95.77％，二者的符合率为62.91％。将湖北汉川、荆州和武汉市江夏区、黄陂区等地送检的472份鸭血清采用建立的OmpA-ELISA检测方法进行检测，结果表明RA抗体阳性率为64.6％，说明建立的间接OmpA-ELISA检测方法能够很好的应用于临床RA抗体检测。
　　 4．应用选择性捕获转录序列技术（SCOTS）筛选鸭疫里氏杆菌在感染鸭肝脏中差异表达的基因的研究
　　 根据RA D-24105株16S rRNA基因序列（GeneBank登录号：AY871819），合成特异性引物，PCR扩增了RA-YM株16S rRNA基因，克隆到pMD18-T，获得重组质粒pT-16SrDNA并进行测序，结果表明克隆的RA-YM株16S rRNA为1479bp，其GeneBank登录号为FJ031240。比对分析Genbank中已公布的表皮葡萄球菌（GeneBank登录号：NC002737），多杀巴氏杆菌（GeneBank登录号：NC002663）、大肠杆菌（GeneBank登录号：NC000913）和噬二氧化碳单胞菌（GeneBank登录号：AY661855）23S rRNA基因序列的保守区域，利用Primer premier5.0设计3对引物，分3段分别扩增了23S rRNA基因，克隆到pMD18-T，获得重组质粒pT-23S2、pT-23S1和pT-23S3并进行测序，拼接结果表明克隆的RA-YM株23S rRNA为2655bp，其GeneBank登录号为FJ031241。对生物素标记的RA-YM基因组DNA和构建好的RA-YM核糖体rDNA质粒（pT-16SrDNA，pT-23S-1rDNA和pT-23S-3rDNA）超声破碎，凝胶电泳结果表明破碎产物大小为100-2000bp。
　　 以血清1型RA-YM感染9日龄樱桃谷肉鸭，提取感染鸭肝脏的总RNA和TSB培养基中生长的RA-YM的总RNA，经SuperScriptTMⅢ RTase反转录，Klenow酶合成cDNA第二链后，记为体内感染cDNAs（in vivo cDNAs）和RA-YM体外培养cDNAs（in vitro cDNAs）。对in vivo cDNAs和in vitro cDNAs进行3轮SCOTS，得到均一化的RA-YM在体内感染时转录的cDNAs和在TSB培养时转录的cDNAs，通过3轮差异杂交选择性捕获RA-YM在感染鸭肝脏中差异表达的基因，将RA-YM在感染鸭肝脏中差异基因的PCR产物克隆到pMD18-T载体，转化E．coli DH5 a感受态细胞，通过PCR和斑点杂交，从文库中筛选出187个差异克隆，经序列测定和比对分析获得了48个RA-YM在感染鸭肝脏中差异表达的基因。Real-time RT-PCR对甘氨酸裂解酶T亚基，尿黑酸1，2-加氧酶，天冬氨酸转氨酶，触酶，磷酸盐转运蛋白．，二肽肽酶Ⅳ，肽酶M28，和RA46等8个基因的差异表达情况进行验证，结果表明与生长于TSB培养基RA的基因表达水平相比，这8个基因在RA感染过程中的表达水平上调1.44-4.62倍，t-检验分析表明8个基因的表达水平差异显著。根据基因功能，将48个基因分为六类：合成与代谢，适应性调节，应激，转运系统，蛋白酶和5个未知功能序列。本研究初步揭示了RA在感染鸭肝脏的基因表达情况，获得的差异表达基因对研究RA在宿主体内的存活、增殖及持续感染具有重要的作用。
　　 本研究筛选到二肽肽酶Ⅳ（Dipeptidyl peptidaseⅣ，DPPⅣ）可能是RA重要的毒力因子。DPP IV是一种丝氨酸蛋白酶，能特异性水解氨基端第二位是脯氨酸的多肽。牙龈卟啉单胞菌的DPPⅣ能够降解结缔组织以及介导牙龈卟啉单胞菌与纤粘蛋白的粘附，缺失dppⅣ基因的牙龈卟啉单胞菌的毒力明显降低。格氏链球菌的DPPⅣ可以酶解P物质，协同胞外精氨酸蛋白酶酶解缓激肽，导致血管通透性的变化及感染的内皮组织平滑肌的收缩。雏鸭感染鸭疫里氏杆菌后，主要病理变化是全身各组织器官的浆膜面出现广泛性的纤维素性渗出，RA感染严重损伤了雏鸭的血管内皮系统，导致血管通透性的增高。因此，二肽肽酶Ⅳ可能是RA关键的毒力因子。
　　 下一步研究将克隆、表达和缺失RA的dppⅣ基因，以及利用酵母双杂交系统筛选和鉴定与DPPⅣ互作的宿主蛋白，为进一步研究dppⅣ对RA的毒力以及RA的致病机理奠定基础。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略语表

声明

第一章文献综述

前言

1病原学研究进展

1.1分类地位

1.2生物学特性

1.3血清型

1.4病原分子生物学

2临床学研究进展

2.1流行病学

2.2临床症状及病理学研究

2.3诊断方法

3防治

3.1药物防治

3.2疫苗防治

4细菌基因差异表达研究技术进展

4.1体内表达技术

4.2代表性差别分析技术

4.3信号标签诱变技术

4.4差异荧光诱导技术

4.5体内诱导抗原技术

4.6 DNA微阵列技术

4.7选择性捕获转录序列

第2章鸭疫里氏杆菌平板染色诊断抗原的制备和应用

1研究的目的和意义

2材料与方法

2.1材料

2.2方法

3结果与分析

3.1鸭疫里氏杆菌平板染色诊断抗原的特异性

3.2鸭疫里氏杆菌平板染色诊断抗原的敏感性

3.3平板凝集染色诊断抗原的重复性

3.4鸭疫里氏杆菌临床分离菌株血清型鉴定结果

3.6兔抗鸭IgG血清抗体水平及纯化后的浓度

3.7兔抗鸭IgG-HRP工作浓度测定

4讨论

4.1鸭疫里氏杆菌抗体检测

4.2鸭疫里氏杆菌血清分型

4.3关于免疫程序

5结论

第三章鸭疫里氏杆菌OmpA基因的克隆、表达及重组OmpA蛋白免疫保护性试验研究

1目的和意义

2材料与方法

2.1材料

2.2主要溶液的配制

2.3方法

3结果与分析

3.1鸭疫里氏杆菌OmpA基因的克隆与测序

3.2表达载体pGEX-OmpA构建与鉴定

3.3表达产物的SDS-PAGE分析和Western-blot鉴定

3.4重组OmpA蛋白的免疫保护性试验结果

4讨论

5结论

第四章鸭疫里氏杆菌间接OmpA-ELISA检测方法的建立和初步应用

1研究目的和意义

2材料与方法

2.1材料

2.2方法

3结果与分析

3.1抗原最佳包被浓度和血清最佳稀释度的确定

3.2间接OmpA-ELISA的判断标准

3.3特异性试验

3.4重复性试验

3.5间接OmpA-ELISA方法与平板凝集方法的对比试验

3.6包被抗原保存期的测定

3.7间接OmpA-ELISA的临床应用

4讨论

4.1重组表达蛋白的提取和复性

4.2包被抗原

4.3间接OmpA-ELISA检测方法

5结论

第五章应用选择性捕获转录序列技术筛选鸭疫里氏杆菌在感染鸭肝脏中差异表达基因的研究

1研究的目的和意义

2材料与方法

2.1材料

2.2方法

3结果与分析

3.1 RA-YM基因组的提取

3.2 RA-YMl6S rDNA基因的克隆与测序

3.3 RA-YM23S rDNA基因的扩增与测序

3.4生物素标记的RA-YM基因组及核糖体质粒的破碎

3.5总RNA的提取及纯化

3.6双链cDNA PCR扩增

3.7选择性捕获转录序列结果

3.8感染过程中差异表达基因的选择性富集结果

3.9差异表达基因的克隆

3.10斑点杂交筛选结果

3.11差异表达基因的Real-time RT-PCR验证结果

3.12基因归类分析

4讨论

4.1生物合成和代谢

4.2适应性反应和相关调节

4.3适应性调节

4.4蛋白酶

5结论

参考文献

研究生期间发表的主要论文

致 谢