肉鸡胫骨软骨发育不良CyclinI，Matrilin3基因的免疫组化与原位杂交研究

摘要

肉鸡胫骨软骨发育不良（Tibial Dyschondroplasia，TD）是肉鸡常见的腿病之一，以胫骨软骨内骨化受阻和胫骨干骺端的软骨细胞增生形成无血管的玉白色的“软骨楔”为特征。TD的发生与品种、营养、环境、管理等因素有关。TD对养鸡业造成重大经济损失，近年来对TD的研究逐渐深入，但其发病机理仍有待于进一步探明。
　　 CyclinⅠ，细胞周期调节因子Ⅰ，属于细胞周期调节蛋白（Cyclin）家族，在细胞的分裂与增殖过程中起着重要作用，能调控细胞周期、促进细胞生长、细胞粘附、细胞迁移、诱导细胞凋亡，调控肿瘤生长、血管发生和软骨内骨化；Matrilin3，是一族非胶原性细胞外基质蛋白家族一员，主要参与胞外基质纤维的形成，并可与胶原或非胶原蛋白相连接，调节胶原纤维与其它基质如蛋白聚糖之间的相互作用，其表达异常可导致骨骺发育不良，骨关节炎等疾病。目前对于二者在肉鸡TD发生发展中的表达变化研究还较少。
　　 在本课题研究小组前期的研究中，应用抑制消减杂交（SSH）技术及基因芯片技术筛选出肉鸡TD差异表达基因，其中就包括CyclinI和Matrilin3。为探求二者在肉鸡TD不同阶段的差异表达情况，本实验采用免疫组化和原位杂交方法分别从蛋白和基因水平对肉鸡TD发生中CyclinI和Matrilin3基因差异表达的时序性进行研究，取得的结果如下：
　　 经动物实验，利用福美双成功诱发肉鸡TD，分四次采样，取胫骨软骨生长板，制作组织石蜡切片，提取RNA，构建了pGEM-T-CyclinI、pGEM-T-Matrilin3克隆载体，提取质粒分别酶切，标记DIG-cRNA探针，进行原位杂交。CyclinI原位杂交结果显示，与对照组相比，在肉鸡TD中CyclinI在不同时期都出现上调和下调的现象：第1、3、4次采样下调表达，第2次采样上调表达。
　　 Matrilin3原位杂交结果显示，TD组Matrilin3在不同时期也出现上调和下调表达，与对照组比较，第1、2次采样TD组下调表达，而第3、4次上调表达。
　　 Matrilin3进行免疫组化，研究发现，与正常组相比，TD组第1、2、3次采样为下调，第4次采样表现为上调。
　　 研究表明，TD发病过程中CyclinI和Matrilin3在基因和蛋白水平都出现了不同程度的变化，说明CyclinI和Matrilin3参与了肉鸡TD的发生发展过程，这将为未来继续研究TD发病的分子机理提供新的理论依据。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略语表

声明

1文献综述

1.1肉鸡胫骨软骨发育不良

1.1.1正常胫骨软骨发育的特征

1.1.2胫骨软骨发育不良的特征

1.1.3胫骨软骨发育不良的原因

1.1.4胫骨软骨发育不良研究现状

1.2细胞周期蛋白Cyclin家族

1.2.1细胞周期蛋白的发现

1.2.2细胞周期蛋白的种类

1.2.3细胞周期蛋白的作用机制

1.2.4细胞周期蛋白Ⅰ(Cyclin Ⅰ)

1.3 Matrilin蛋白家族

1.3.1软骨基质

1.3.2 Matrilin蛋白

1.3.3关于Matrilin 3

2研究目的及意义

3材料与设备

3.1实验动物

3.2质粒和菌种

3.3主要生物学试剂

3.3.1分子克隆相关试剂

3.3.3原位杂交相关试剂

3.3.3免疫组化相关试剂

3.4主要溶液及试剂配制

3.4.1抗生素类

3.4.2细菌培养基

3.4.3质粒抽提相关溶液

3.4.4组织固定包埋使用试剂

3.4.5免疫组化相关溶液配制

3.4.6原位杂交相关溶液配制

3.5实验器材及仪器

4方法与步骤

4.1动物实验

4.1.1动物模型建立

4.1.2组织的取样和保存

4.1.3组织包埋

4.2克隆载体的构建

4.2.1总RNA的提取

4.2.2引物设计

4.2.3 RT-PCR反应体系

4.2.4 PCR产物的回收与纯化

4.2.5感受态细胞的制备

4.2.6目的片段与载体的连接

4.2.7质粒的制备(小量制备，碱裂解法)

4.2.8质粒的转化

4.2.9重组质粒的鉴定

4.2.10重组质粒测序

4.3原位杂交

4.3.1玻片的预处理

4.3.2软骨组织切片的制备

4.3.3探针的制备

4.3.4原位杂交

4.4免疫组化

4.4.1玻片的预处理

4.4.2组织固定及包埋

4.4.3切片制备

4.4.4脱蜡

4.4.5抗原修复

4.4.6 5％BSA封闭

4.4.7 一抗孵育

4.4.8 二抗孵育

4.4.9加SABC

4.4.10显色

4.4.11复染

4.4.12脱水

4.4.13封片

5结果与分析

5.1总RNA提取及Cyclin Ⅰ、Matrilin3基因的RT-PCR扩增

5.2重组克隆质粒鉴定

5.3质粒线性化

5.4探针合成及效率检测

5.5 CyclinI原位杂交染色结果

5.6 Matrilin3原位杂交染色结果

5.7 Matrilin3免疫组化染色结果

6讨论

6.1肉鸡胫骨软骨RNA的提取与Cyclin Ⅰ、Matrilin3基因的扩增

6.2 CyclinⅠ、Matrilin3基因的克隆

6.3 CyclinⅠ的原位杂交

6.4 Matrilin3的原位杂交

6.5 Matrilin3的免疫组化

总 结

参考文献

致 谢