水稻OsCPK2、OsCPK15和OsCPK29的功能鉴定

摘要

胞质Ca2+是重要的第二信使，通过Ca2+结合蛋白产生磷酸化信号级联，调控下游基因表达。钙依赖而钙调素不依赖的蛋白激酶（calcium-dependent/calmodulin-independent protein kinases，CDPKs）是一类仅在植物和部分原生生物中存在的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，在钙信号转导中具有重要功能。越来越多的证据表明，CDPKs广泛参与植物生长发育、病原防御、非生物环境胁迫等生理反应的信号传递过程。目前在水稻中已发现31个CDPKs基因，但功能明确的只有少数几个基因，本研究的目的就是利用超量表达和RNA干涉（RNA interference，RNAi）技术分析水稻OsCPK2、OsCPK15和OsCPK29的功能，为利用基因工程技术培育水稻新品种提供新的基因资源和理论指导。本研究的主要试验结果如下：
　　 1．通过RT-PCR方法检测了OsCPK2、OsCPK15和OsCPK29三个基因在粳稻品种日本晴分蘖期的根、成熟叶片、穗尖至剑叶叶枕距离分别为0 cm、0-1cm、1-3 cm、3-5 cm、5-8 cm、8-12 cm、12-16 cm、16-20 cm、20-25 cm、25-30 cm、灌浆期稻穗（命名为P1-P12）中的表达谱。试验结果显示：OsCPK2和OsCPK29在P2-P11时期稻穗中表达量较高，在成熟叶片和P12时期稻穗中表达量很低，在分蘖期的根和幼穗中不表达；而OsCPK15在所检测的各个组织和时期中表达量均很高。表达谱结果说明OsCPK2和OsCPK29的表达具有组织时空特异性，而OsCPK15是组成型表达。
　　 2．构建了OsCPK2超量表达载体p1300S-CPK2，通过根癌农杆菌介导法转化日本晴愈伤组织，得到42株再生植株。通过Southern blot和Northern blot检测，共得到16株单拷贝植株、4株单拷贝超量表达植株。
　　 3．构建了OsCPK15超量表达载体p1300S-CPK15，通过根癌农杆菌介导法转化日本晴愈伤组织，得到43株再生植株。通过Southern blot和Northern blot检测，共得到11株单拷贝植株、2株单拷贝超量表达植株。
　　 4．构建了OsCPK29超量表达载体p1300S-CPK29，通过根癌农杆菌介导法转化日本晴愈伤组织，得到74株再生植株。PCR检测结果显示阳性率为92％。通过Southern blot和Northern blot检测，共得到11株单拷贝植株、4株单拷贝超量表达植株。
　　 5．对OsCPK29 T2代转基因家系进行花粉育性考察，结果显示转基因植株花粉育性与野生型相比没有明显降低。
　　 6．对OsCPK29 T2代转基因家系进行干旱、高盐、低温3种非生物逆境胁迫处理，通过表型观察发现转基因植株的抗旱性、耐盐性、抗寒性与对照相比没有明显差异。同时还对OsCPK29 T2代转基因家系进行甘露醇胁迫和ABA敏感性试验，结果显示处理后转基因植株与对照相比没有明显差异。
　　 7．对OsCPK29T2代转基因家系进行叶片衰老进程检测，结果显示，OsCPK29超量表达植株叶片衰老延迟。同时测量了处理前后转基因植株和对照的离体剑叶叶绿素含量，结果显示，处理前转基因植株和对照离体剑叶叶绿素含量没有明显差异，而在处理后转基因植株离体剑叶叶绿素含量极显著地高于对照。
　　 8．构建了OsCPK2、OsCPK15和OsCPK29 RNAi载体pDS1301-CPK2、pDS1301-CPK15和pDS1301-CPK29，通过根癌农杆菌介导法转化日本晴愈伤组织，分别得到39株、38株、43株再生植株。通过PCR检测，阳性率均在90％以上。
　　 9．通过RT-RCR方法分别检测了OsCPK2、OsCPK15和OsCPK29抑制表达植株中相应基因的表达量。结果显示与日本晴野生型相比，这三个基因均未被抑制。
　　 10．构建了OsCPK2、OsCPK15和OsCPK29亚细胞定位载体p1391aGFP-CPK2、p1391aGFP-CPK15和p1391bGFP-CPK29。利用基因枪将包被载体质粒的金粉分别导入洋葱表皮细胞，通过激光共聚焦显微镜观察到融合蛋白OsCPK2-GFP、OsCPK15-GFP和OsCPK29-GFP均定位在细胞质。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略语表

声明

1前言

1.1研究问题的由来

1.2文献综述

1.2.1植物中Ca2+参与的信号转导

1.2.2作为Ca2+传感蛋白的植物蛋白激酶

1.2.3 CDPKs概述

1.3研究目的

2材料与方法

2.1试验材料

2.1.1受体植物

2.1.2菌株

2.1.3载体

2.1.4外源片段

2.2试验方法

2.2.1表达谱分析

2.2.2 OsCPK2、OsCPK15和OsCPK29超量表达载体的构建

2.2.3 OsCPK2、OsCPK15和OsCPK29 RNAi载体的构建

2.2.4根癌农杆菌介导的遗传转化

2.2.5再生植株的阳性检测

2.2.6 T0代转基因植株的拷贝数检测

2.2.7 T0代转基因植株表达量检测

2.2.8 OsCPK29超量表达植株花粉育性考察

2.2.9 OsCPK29超量表达植株非生物逆境胁迫试验

2.2.10 OsCPK29超量表达植株叶片衰老进程检测

2.2.11通过瞬时表达分析OsCPK2、OsCPK15和OsCPK29的亚细胞定位

3结果与分析

3.1 OsCPK2、OsCPKJ5和OsCPK29表达谱分析结果

3.2 OsCPK2、OsCPKJ15和OsCPK29超量表达植株相关试验结果

3.2.1 OsCPK2超量表达植株相关试验结果

3.2.2 OsCPKl5超量表达植株相关试验结果

3.2.3 OsCPK29超量表达植株相关试验结果

3.3 OsCPK2、OsCPKJ15和OsCPK29 RNAi植株相关试验结果

3.3.1 OsCPK2、OsCPK15和OsCPK29 RNAi载体的构建

3.3.2 OsCPK2、OsCPK15和OsCPK29 RNAi再生植株的获得

3.4 OsCPK2、OsCPK15和OsCPK29亚细胞定位结果

3.4.1 OsCPK2、OsCPK15和OsCPK29亚细胞定位载体的构建

3.4.2 OsCPK2、OsCPK15和OsCPK29亚细胞定位结果

4讨论

4.1关于OsCPK29超量表达植株方面

4.2关于OsCPK2、OsCPK15和OsCPK29 RNAi植株方面

4.3试验中的不足之处

参考文献

致谢

附录