梅花再生体系建立及遗传转化初步研究

摘要

梅花(Prunus mume Sieb.et Zucc.),属于蔷薇科(Rosaceae)李属(Prunus)植物,是中国十大传统名花之一,极具观赏性。然而,梅花的抗寒品种极少。传统的梅花品种选育及品质改良方法存在周期长、偶然性大等问题,而借助植物遗传转化技术则可克服传统方法的局限性。要获得转基因新品种,最重要的前提是建立遗传转化所需的植株再生体系。本实验对梅花体细胞胚发生、增殖及植株高效再生,以及梅花胚轴及子叶植株再生进行了系统的研究,并对以梅花子叶为受体的遗传转化体系进行了摸索,主要结果如下:
　　 (1)梅花体细胞胚的发生、增殖及植株高效再生
　　 以‘雪梅’(P.mume‘Xue Mei’)、‘江梅’(P.mume‘Jiang Mei’)及‘米单绿’(P.mume‘Mi Darllv’)的幼胚为外植体,对梅花初生体胚的发生、次生体胚的诱导及植株再生的方法进行了研究。结果表明:盛花后约52-59 d的幼胚在添加2,4-D1.0-2.0 mg/L+BA0.1-0.5 mg/L的1/2 MS培养基上暗培养60 d后,可直接诱导出初生体胚,诱导率及平均诱导数最高可达58.33％及3.6个。采样时期、激素组合、品种之间均存在极显著差异；采样时期与激素组合、采样时期与品种、激素组合与品种之间均存在交互作用。光照培养对次生体胚诱导起关键作用,其次,3-4％的蔗糖对次生体胚诱导有明显的促进作用。在添加TDZ0.005-0.01 mg/L+BA0.1 mg/L+NAA0.05 mg/L的1/2 MS培养基上光照培养60 d后,次生体胚出胍率及平均诱导数最高分别可达96.67％及5.7个。体细胞胚在添加GA0.5 mg/L的1/2 MS培养基上培养20 d后,萌发率最高可达90.44％。再生植株在1/2MS+NAA0.5 mg/L培养基上正常牛长且顺利生根,并移栽成活。
　　 (2)梅花上胚轴及下胚轴植株再生
　　 以‘雪梅’及‘米单绿’成熟胚萌发后的上胚轴及下胚轴为外植体,研究了形态学位置、暗培养时间、苗龄及不同激素组合等对其再生的影响。结果表明:暗培7、14、21、28、35 d种胚均未萌发,而剥除种皮后的‘雪梅’及‘米单绿’约在10 d后即可萌发,表明种皮障碍是抑制了梅花种胚萌发的重要因为。1200-1600 mg/L的GA处理12 h会促进‘雪梅’种胚的萌发,400-800 mg/L的GA处理12 h会促进‘米单绿’种胚的萌发。影响胚轴不定芽诱导的因素主要有形态学位置、暗培养时间、苗龄及激素组合。形态学位置对上胚轴再生影响不显著,而对下胚轴不定芽诱导率及平均再生芽数均有显著差异。‘雪梅’及‘米单绿’下胚轴上端的不定芽诱导率及平均再生芽数均达最高,下胚轴的下端均未诱导出不定芽；暗培养时间对上胚轴及下胚轴分化不定芽起十分重要的作用,以暗培养3 d最佳；苗龄为12 d时,上胚轴及下胚轴诱导不定芽最佳；‘雪梅’上胚轴在TDZ0.02 mg/L+BA1.0 mg/L+NAA0.1 mg/L上培养时,不定芽诱导率及平均不定芽诱导数均达最高,分别为27.78％及2.7个；‘米单绿’上胚轴在TDZ0.04 mg/L+BA0.0 mg/L,+NAA0.1 mg/L上培养时,不定芽诱导率及平均不定芽诱导数均达最高,分别为26.39％及2.5个；激素对‘雪梅’上胚轴不定芽诱导率及平均不定芽诱导数影响的顺序均为TDZ>BA>NAA,对‘米单绿’不定芽诱导率及平均不定芽诱导数影响的顺序均为TDZ>NAA>BA。‘雪梅’下胚轴在TDZ0.02 mg/L+BA2.0 mg/L+NAA0.2 mg/L上培养时,不定芽诱导率及平均不定芽诱导数均达最高；‘米单绿’下胚轴在TDZ0.04 mg/L+BA2.0 mg/L+NAA0.0 mg/L上培养时不定芽诱导率及平均不定芽诱导数均达最高。激素对‘雪梅’下胚轴不定芽诱导率及平均不定芽诱导数影响的顺序为BA>NAA>TDZ,对‘米单绿’下胚轴不定芽诱导率及平均不定芽诱导数影响的因素顺序为BA>TDZ>NAA。
　　 (3)梅花子叶植株再生
　　 以‘雪梅’及‘米单绿’成熟胚的子叶为外植体,对梅花子叶植株再生进行研究。‘雪梅’的子叶在TDZ0.4 mg/L+BA1.0mg/L+NAA0.2 mg/L上培养时,不定芽诱导率及平均不定芽诱导数均达最高,分别为91.67％及19.1个；‘米单绿’的子叶在TDZ0.2 mg/L+BA2.0 mg/L+NAA.0.2mg/L上培养时,不定芽诱导率及平均不定芽诱导数均达最高,分别为89.58％及16.19个。不添加BA时,‘雪梅’和‘米单绿’的子叶均未诱导出不定芽。激素对‘雪梅’子叶不定芽诱导率及平均再生芽数影响的顺序为BA>NAA>TDZ,对‘米单绿’子叶不定芽诱导率及平均再生芽数影响的顺序为BA>TDZ>NAA。
　　 (4)梅花子叶遗传转化
　　 以‘雪梅’及‘米单绿’子叶为遗传转化的受体,研究此转化体系的最佳实验参数。结果表明:预培养3 d,侵染20 min,以Km20 mg/L及Cef300 mg/L为筛选压,共培养3 d时的转化效果最好。

目录

文摘

英文文摘

缩略词表

第一部分 文献综述

1 引言

2 木本植物体细胞胚发生的研究概述

2.1 木本植物体细胞胚发生研究现状

2.2 体细胞胚的发生

2.3 体细胞胚的增殖

2.4 体细胞胚的成熟与萌发

2.5 体细胞胚发生的组织学

2.6 木本植物体细胞胚的应用前景

2.7 李属(Prunus)植物体细胞胚发生的研究现状

3 李属植物再生植株研究概述

3.1 叶片再生

3.2 子叶再生

3.3 胚轴再生

3.4 影响再生的因素

4 李属植物遗传转化研究概述

5 本研究的目的和意义

第二部分 梅花体细胞胚的发生、增殖及植株再生

1. 材料与方法

1.1 实验材料

1.2 培养条件及基本培养基

1.3 实验方法

1.4 实验数据的记录与处理

2 结果与分析

2.1 初生体胚诱导

2.2 次生体胚诱导与增殖

2.3 体细胞胚萌发及植株再生

2.4 体细胞胚发生过程的细胞学观察

3 讨论

3.1 不同外植体及发育时期对体细胞胚诱导的影响

3.2 激素对诱导体细胞胚发生的影响

3.3 激素对诱导体细胞胚增殖的影响

3.4 光照对体细胞胚诱导及增殖的影响

第三部分 梅花上胚轴及下胚轴再生

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.2 培养条件及基本培养基

1.3 实验方法

1.4 实验数据的记录与处理

2 结果与分析

2.1 成熟胚萌发实验

2.2 上胚轴再生实验

2.3 下胚轴再生实验

2.4 再生植株的生根与移栽

3 讨论

3.1 内种皮对成熟种胚萌发的影响

3.2 GA浓度及其处理时间对成熟胚萌发的影响

3.3 形态学位置对胚轴再生的影响

3.4 暗培养对胚轴再生的影响

3.5 苗龄对胚轴再生的影响

3.6 不同激素组合对胚胎轴再生的影响

3.7 胚轴再生实验中存在的问题

第四部分 梅花子叶再生

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.2 培养条什及基本培养基

1.3 实验方法

1.4 实验数据的记录与处理

2 结果与分析

2.1 不同激素组合对子叶再生的影响

2.2 再生植株的生根与移栽

3 讨论

第五部分 梅花子叶遗传转化初探

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.2 实验药品

1.3 再生体系的建立

1.4 遗传转化技术路线

1.5 根癌农杆菌的活化与保存

1.6 抗生素敏感性筛选实验

1.7 遗传转化条件的研究

1.8 GUS瞬间表达的检测

1.9 实验数据的记录与处理

2 结果与分析

2.1 不同浓度Km对子叶再生的影响

2.2 不同浓度Cef对子叶再生的影响

2.3 选择培养基的初步确定

2.4 预培养时间对转化的影响

2.5 侵染时间对转化的影响

2.6 共培养时间对转化的影响

2.7 GUS瞬间表达的检测

2.8 最佳遗传转化体系的获得

3 讨论

参考文献

致谢