表达猪2型圆环病毒Cap蛋白重组沙门氏菌的构建及鉴定

摘要

猪2型圆环病毒（Porcine eircovirus type2，PCV2）是当前严重危害世界养猪业的重要病原之一。该病毒与猪的多种疾病综合征有关，特别是断奶仔猪多系统衰竭综合征，该病最早于1991年在加拿大西部发现，随后以极高的感染率迅速在全球蔓延流行，其临床症状主要表现为进行性消瘦、呼吸道症状、发热、苍白及黄疸等。PCV2在猪群中的感染率非常高，但多为隐性感染，该病主要侵害机体的免疫系统，导致免疫抑制，造成继发感染，给全球养猪业造成巨大的经济损失。对本病的预防除加强饲养管理、搞好环境卫生和减少应激外，最主要的途径就是依靠疫苗，因此，研制安全、高效、制备方便和廉价的新型基因工程疫苗成为越来越多研究者关注的焦点。
　　 本研究对PCV2新型疫苗进行了新的探索，构建了利用猪霍乱沙门氏菌载体系统表达Cap蛋白的重组菌，利用重组菌对小鼠进行了免疫学效力研究，主要研究内容如下：
　　 1．猪2型圆环病毒Cap蛋白单克隆抗体的制备
　　 利用本实验室构建的PCV2-ORF2重组菌经IPTG诱导表达，得到融合蛋白GST-Cap，采用谷胱甘肽琼脂糖凝胶对可溶性蛋白进行纯化，并作为免疫原采取常规皮下免疫与尾静脉冲击免疫结合的方式免疫BALB/c小鼠。取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合，经间接酶联免疫吸附试验（ELISA）筛选，采用有限稀释法进行克隆，经过3次克隆后获得了2株抗Cap蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞，分别命名为3E5和4H8。Western-blot和间接免疫荧光结果显示3E5和4H8株单克隆抗体能与Cap蛋白和PCV2发生特异性反应。其抗体亚类类型分别为IgG2a和IgG2b，轻链为κ型，细胞培养上清效价均为1：1024，小鼠腹水效价分别为1：409600和1：204800。这2株单抗的获得为进一步研究PCV2-ORF2基因的功能及建立准确快速诊断PCV2的方法提供了强有力的手段。
　　 2．表达猪2型圆环病毒Cap蛋白重组沙门氏菌的构建及鉴定
　　 根据GenBank中的已知序列设计2对引物，分别扩增PCV2-ORF2全基因和去核定位序列的ORF2基因，然后将两个片段分别亚克隆至含asd+基因及β-lactamase信号序列的原核表达质粒pYA3493中，得到重组质粒pYA-ORF2和pYA-△41ORF2。将pYA-ORF2、pYA-△41ORF2和pYA3493分别电转化猪霍乱沙门氏菌C500的asd缺失株C501中，制备重组菌株C501（pYA-ORF2）、C501（pYA-△41ORF2）和空载体菌株C501（pYA3493）。SDS-PAGE鉴定表明，去核定位信号的ORF2基因可以表达，而含全基因序列的ORF2基因未表达。Western-blot结果表明：去核定位信号的ORF2基因表达的蛋白可以与抗PCV2-ORF2单克隆抗体发生特异性反应。研究结果表明，重组菌株C501（pYA-△41ORF2）不仅保留了亲本菌株C500的表型特征，且能稳定遗传并分泌表达外源蛋白。将5.9×10 CFU的重组菌C501（pYA-△41ORF2）分别以口服和肌肉注射途径免疫小鼠，结果显示两种免疫方法均可以诱导一定程度的ORF2特异的体液免疫反应，抗体从第1周开始略有上升，单剂量免疫组抗体从第4周开始下降，加强免疫后抗体上升。

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文摘

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论文说明：缩略词

声明

1文献综述

1.1猪圆环病毒病原学研究进展

1.1.1病毒的发现

1.1.2病毒的培养特性

1.1.3 PCV基因组结构

1.1.4 ORF2基因的研究进展

1.2 PCV2诊断技术研究进展

1.2.1病原学方法

1.2.2血清学方法

1.3 PCV2疫苗研究进展

1.3.1灭活疫苗

1.3.2弱毒疫苗

1.3.3基因工程疫苗

1.4猪圆环病毒单克隆抗体研究进展

1.5减毒沙门氏菌载体研究进展

1.5.1 减毒沙门氏菌载体的优点

1.5.2减毒沙门氏菌载体改进

1.5.3沙门氏菌载体的应用

2研究的目的与意义

3材料与方法

3.1 实验材料

3.1.1 菌种、质粒

3.1.2细胞和试验动物

3.1.3主要试剂和试剂盒

3.1.4主要培养基及试剂的配制

3.2实验方法

3.2.1抗原制备

3.2.2小鼠免疫

3.2.3间接ELISA检测方法的建立

3.2.4细胞融合

3.2.5 Western-blot分析

3.2.6间接免疫荧光

3.2.7交叉试验

3.2.8单克隆抗体Ig亚型的测定

3.2.9单克隆抗体生产

3.2.10单抗效价(腹水)测定

3.2.11杂交瘤细胞冻存和复苏

3.2.12单克隆抗体稳定性鉴定

3.2.13腹水中单抗的纯化

3.2.14质粒的小量制备

3.2.15 PCV2-ORF2全基因和去核定位信号ORF2基因的扩增

3.2.16 PCR或酶切产物的回收与纯化

3.2.17大肠杆菌χ6097感受态细胞的制备(氯化钙法)

3.2.18连接产物的转化

3.2.19重组质粒的鉴定

3.2.20重组质粒的酶切鉴定

3.2.21 沙门氏菌电转化感受态细胞的制备

3.2.22沙门氏菌的电转化

3.2.23重组菌株的鉴定

3.2.24重组菌株的分泌表达

3.2.25重组菌株的表型鉴定

3.2.26重组菌株生长特性分析

3.2.27重组菌株的遗传稳定性

3.2.28重组菌株对小鼠的免疫试验

3.2.29沙门氏菌ELISA检测方法的建立

4结果与分析

4.1单克隆抗体的制备

4.1.1重组蛋白的提取

4.1.2间接ELISA方法的确定

4.1.3细胞融合后的观察

4.1.4阳性杂交瘤细胞筛选及克隆

4.1.5 Western-blot

4.1.6间接免疫荧光

4.1.7交叉实验

4.1.8单克隆抗体的效价

4.1.9单克隆抗体亚类鉴定

4.1.10稳定性检测

4.1.11单克隆抗体的纯化

4.2表达猪2型圆环病毒Cap蛋白重组沙门氏菌的构建

4.2.1 PCV2-ORF2全基因和去核定位信号ORF2的克隆

4.2.2重组质粒pYA-ORF2和pYA-△41ORF2的构建与鉴定

4.2.3重组菌株C501(pYA-ORF2)和C501(pYA-△41ORF2)的构建与鉴定

4.2.4重组菌株C501(pYA-ORF2)和C501(pYA-△41ORF2)的分泌表达

4.2.5重组菌株C501(pYA-△41ORF2)的表型鉴定

4.2.6重组菌株C501(pYA-△41ORF2)的生长特性研究

4.2.7重组菌株C501(pYA-△41ORF2)的遗传稳定性

4.2.8重组菌株C501(pYA-△41ORF2)对小鼠的免疫试验

4.3讨论

4.3.1动物免疫

4.3.2细胞融合

4.3.3筛选与克隆

4.3.4污染和控制

4.3.5单克隆抗体的纯化

4.3.6 NLS对表达ORF2基因的影响

4.3.7细菌载体的选择

4.3.8 PCV2-ORF2基因在C500crp-/asd-缺失株平衡致死系统中的表达

5结论

参考文献

致谢