猪水肿病与仔猪副伤寒二价基因工程疫苗研究

摘要

猪水肿病是由特定血清型产类志贺氏毒素大肠杆菌（Shiga-like toxin Escherichia coli，SLTEC）引起猪的一种急性、致死性传染病，发病率低，但病死率高，幸存者发育迟缓，饲料回报率低，给养猪业带来很大的经济损失。猪霍乱沙门氏菌（Salmonella Choleraesuis）是导致2-4月龄仔猪副伤寒的主要病原，过去曾是危害我国养猪业的主要疾病之一，现在在我国特别是农村散养户普遍存在，造成一定经济损失。
　　 产类志贺毒素大肠杆菌的两个主要毒力因子是F18ab菌毛与类志贺毒素Ⅱ型变异体（SLT-Ⅱe）。编码F18ab的基因有6个：fedA、fedB、fedC、fedD、fedE和fedF。Smeds A等（2001）利用融合蛋白对F18菌毛粘附特性作了进一步的研究，表明纯化的FedF与细菌的粘附相关。SLT-Ⅱe毒素是由一个A亚基和5个B亚基共同组成的聚合体。SLT-Ⅱe的B亚基没有毒性，而具有免疫原性，是水肿病毒素的主要保护性抗原。
　　 沙门氏菌作为疫苗活载体已受到学界的广泛重视，其主要优点包括沙门氏菌可以经口服或鼻内途径免疫，操作方便，对接种对象应激小。此外，沙门氏菌为胞内侵袭细菌，可以有效呈递抗原，并激发抗沙门氏菌和诱导外源蛋白的特异性体液与细胞免疫反应，并能同时诱导粘膜免疫与全身免疫。
　　 基于以上原因，希望构建以沙门氏菌作为载体表达融合基因SLT-ⅡeB与FedF，得到一种疫苗可以同时预防仔猪水肿病和沙门氏菌病。主要研究内容包括：
　　 1、重组质粒pYA-SF的构建
　　 参照GenBank中大肠杆菌EC0412A株SLT-ⅡeB和FedF序列设计引物，以WH3基因组为模板扩增并克隆SLT-ⅡeB与FedF基因，扩增片段大小为204bp和840bp，前者引物引入EcoRⅠ和SalⅠ酶切位点，后者引入SalⅠ和HindⅢ酶切位点。回收PCR产物，连接pMD18-T，得到质粒pMD18-SLT-ⅡeB-FedF，用EcoRⅠ和HindⅢ分别对质粒pMD-SLT-ⅡeB-FedF和pYA3493双酶切，回收、连接、转化Asd大肠杆菌X6097，得到质粒pYA-SLT-ⅡeB-FedF（缩写为pYA-SF）。
　　 2、重组菌株C501（pYA-SF）的构建与鉴定
　　 将重组平衡表达质粒pYA-SF电转化AasdC500缺失株，在无DAP的LB平板上筛选阳性重组子。用引物pa7/pa6对重组菌株进行鉴定，可以扩增出△asd缺失型菌株的2，229 bp片段，而亲本菌C500则扩增出4，000 bp的片段；引物ps1/ps2扩增出SLT-ⅡeB特异性片段204 bp，引物pf1/pf2扩增出FedF特异性片段840 bp，而亲本菌C500则不能扩增出该两种片段。结果表明获得含有pYA-SF质粒的重组菌株是正确的。
　　 3、重组菌株生物学特性的研究
　　 表型研究与生化特性研究表明重组菌株C501（pYA-SF）与亲本株C500相同。生长曲线得出C501（pYA-SF）生长速度与亲本菌株C500相似，而比C500缺失菌株△asdC500（pYA3493）的生长速度稍快。遗传特性研究表明重组菌株可以稳定遗传。SDS-PAGE结果显示，重组菌株可以分泌表达，因为重组菌株C501（pYA-SLT-ⅡeB-FedF）在约37kDa．处有明显的表达带，而空载体对照菌株C501（pYA3493）则没有对应的表达带。
　　 4、基因工程疫苗对小鼠的免疫保护效力研究
　　 皮下免疫小鼠，每周采集小鼠血清，利用间接ELISA检测所有免疫组的IgG抗体，结果表明针对相应抗原的抗体相应增加，加强免疫后抗体平均水平进一步提高。小鼠免疫后30天，分别用猪霍乱沙门氏菌强毒株C78-1（1×107.1CFU）口服攻毒和猪水肿病大肠杆菌强毒株WH3（5×108CFU）腹腔攻毒，亲本菌株C500组和重组菌株免疫组小鼠抵抗10×LD50的猪霍乱沙门氏菌强毒株C78-1的攻击，而PBS对照组小鼠全部死亡，然而重组菌株免疫组和水肿病三价灭活苗组对2.5×LD50大肠杆菌强毒株WH3的攻击差别比较大，重组菌株免疫组只能提供43％的保护率，灭活苗组却能提供89％的保护率，同期的PBS对照组小鼠全部死亡。
　　 5、基因工程疫苗对猪的免疫保护力研究
　　 重组菌株的安全性试验结果发现所有C500（pYA-SF）肌肉注射接种组仔猪的精神食欲正常，未见异常变化。亲本菌株C500接种的仔猪，也没有异常临床表现。将6×109 CFU重组菌株C501（pYA-SF）分别通过肌肉注射途径免疫20日龄仔猪，结果显示免疫仔猪能产生较高水平的抗沙门氏菌和SLTEC重组蛋白rSF的血清IgG，并能抵抗5×LD50猪霍乱沙门氏菌强毒株C78-1的耳静脉攻击（4/4）。同时，免疫仔猪也能抵抗SLTEC强毒株WH3分泌毒素的耳静脉攻毒途径的攻击（3/4），而PBS组（0/4）和C501（pYA3493）载体对照组（1/4）均不能提供有效保护。说明研究构建的猪水肿病与仔猪副伤寒重组二价活疫苗株C501（pYA-SF）能保护免疫仔猪抵抗猪霍乱沙门氏菌和SLTEC的攻击，有望成为实用有效的二价活疫苗株。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词表

声明

1 文献综述

1.1猪水肿病的研究进展

1.1.1猪水肿病的病原学

1.1.2猪水肿病的毒力因子

1.1.3猪水肿病的致病机理

1.1.4猪水肿病的影响因素

1.1.5猪水肿病的诊断

1.1.6猪水肿病的免疫研究

1.2猪沙门氏菌病的研究进展

1.2.1猪沙门氏菌病及其危害

1.2.2猪霍乱沙门氏菌的特征

1.2.3沙门氏菌病的诊断

1.2.4防治策略

1.2.5沙门氏菌疫苗研究进展

1.3弱毒沙门氏菌载体的研究进展

1.3.1弱毒沙门氏菌载体的优点

1.3.2弱毒沙门氏菌载体的缺点及改进方法

1.3.3沙门氏菌载体的应用

2目的与意义

3材料与方法

3.1材料

3.2方法

3.2.1质粒的制备

3.2.2沙门氏菌电转化

3.2.3沙门氏菌和大肠杆菌ELISA检测方法的建立

3.2.4大肠杆菌原核表达

3.2.5重组菌株的构建与鉴定

3.2.6重组疫苗菌株的生物学特性研究

3.2.7重组菌株的毒力试验（赵战勤博士论文，2008）

3.2.8重组疫苗菌株对小鼠的免疫保护性试验

3.2.9重组疫苗菌株对仔猪的免疫保护性试验

4结果与分析

4.1重组菌株的构建与鉴定

4.2重组菌株的生物学特性

4.2.1重组菌株的表型研究结果

4.2.2重组菌株的生长特性鉴定

4.2.3重组菌株的遗传稳定性

4.2.4重组菌株的分泌表达

4.3重组菌株的毒力试验

4.4免疫小鼠的保护性试验

4.4.1免疫小鼠的沙门氏菌抗体检测

4.4.2免疫小鼠针对沙门氏菌攻毒的保护力

4.4.3免疫小鼠针对rSF的抗体检测

4.4.4免疫小鼠针对产志贺氏毒素大肠杆菌攻毒的保护力

4.4.5重组疫苗的细胞免疫评价

4.5重组疫苗对猪的免疫效力研究

4.5.1 重组疫苗对猪的安全性评价

4.5.2重组疫苗免疫猪后抗体检测

4.5.3 重组疫苗免疫猪后的保护性实验研究

5讨论

5.1 融合基因的选择与表达

5.2 SLT-IIeB与FedF融合基因在 C500asd-缺失株平衡致死系统中的表达

5.3重组菌△asd C500(pYA-SF)对动物的免疫试验

6 结论

参考文献

致谢

附录